Fiche 14 • Spectrophotométrie
33
Quant au coefficient d’absorption molaire, compte tenu de la masse molaire de l’hémoglobine, 64 500 g mol –1 :
ε M
M
A
c
,
,
,
415
415
0 98 64 500
0 12 1
527 000
=
=
×
×
=
⋅
l
L mo ol
cm
−
−
⋅
1
1
6. COLORIMÉTRIE
De nombreuses substances dépourvues de propriétés d’absorption des UV ou de la
lumière visible peuvent être détectées à l’aide d’un spectrophotomètre, grâce à l’utilisation d’un réactif qui engendre une coloration spécifique.
Nous prendrons comme exemple le dosage des protéines du sérum au moyen de la méthode
du biuret. Cette méthode consiste à mélanger une dilution de sérum avec un réactif alcalin
contenant des ions cuivriques (réactif de Gornall) ; en milieu fortement alcalin, les ions
Cu ++ forment avec les liaisons peptidiques des complexes de couleur rouge qui absorbent
la lumière autour de 540 nm. Dans la pratique, l’absorbance de l’échantillon contenant le
sérum étudié (dilué 10 fois) est confrontée aux valeurs d’absorbance d’une gamme étalon
de protéine, généralement de l’albumine de sérum bovin (ASB) (tubes 1 à 5) :
Tube
ASB mg
(dans 1 mL d’eau)
Sérum humain
dilué 10 fois
Réactif de Gornall
mL
A 540
1
0
–
4
0
2
2
–
4
0,12
3
4
–
4
0,24
4
6
–
4
0,36
5
8
–
4
0,48
6
1 mL
4
0,41
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0
2
4
6
8
10
A 540
ASB, mg
6,8 mg
Compte tenu de la dilution préalable (au 1/10 e ), la concentration totale de protéine de ce
sérum est estimée à 68 mg mL –1 . Cette valeur se situe dans la fourchette des concentrations considérées comme normales : 60 à 85 mg mL –1 .
9782100724185-Livre.indb 33
20/05/15 19:11
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Quant au coefficient d’absorption molaire, compte tenu de la masse molaire de l’hémoglobine, 64 500 g mol –1 :
ε M
M
A
c
,
,
,
415
415
0 98 64 500
0 12 1
527 000
=
=
×
×
=
⋅
l
L mo ol
cm
−
−
⋅
1
1
6. COLORIMÉTRIE
De nombreuses substances dépourvues de propriétés d’absorption des UV ou de la
lumière visible peuvent être détectées à l’aide d’un spectrophotomètre, grâce à l’utilisation d’un réactif qui engendre une coloration spécifique.
Nous prendrons comme exemple le dosage des protéines du sérum au moyen de la méthode
du biuret. Cette méthode consiste à mélanger une dilution de sérum avec un réactif alcalin
contenant des ions cuivriques (réactif de Gornall) ; en milieu fortement alcalin, les ions
Cu ++ forment avec les liaisons peptidiques des complexes de couleur rouge qui absorbent
la lumière autour de 540 nm. Dans la pratique, l’absorbance de l’échantillon contenant le
sérum étudié (dilué 10 fois) est confrontée aux valeurs d’absorbance d’une gamme étalon
de protéine, généralement de l’albumine de sérum bovin (ASB) (tubes 1 à 5) :
Tube
ASB mg
(dans 1 mL d’eau)
Sérum humain
dilué 10 fois
Réactif de Gornall
mL
A 540
1
0
–
4
0
2
2
–
4
0,12
3
4
–
4
0,24
4
6
–
4
0,36
5
8
–
4
0,48
6
1 mL
4
0,41
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0
2
4
6
8
10
A 540
ASB, mg
6,8 mg
Compte tenu de la dilution préalable (au 1/10 e ), la concentration totale de protéine de ce
sérum est estimée à 68 mg mL –1 . Cette valeur se situe dans la fourchette des concentrations considérées comme normales : 60 à 85 mg mL –1 .
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