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14 Spectrophotométrie
Mots clés
Loi de Beer-Lambert, absorbance, absorptivité molaire, spectres UV-visible, orbitales p délocalisées
1. UTILISATION DE LA SPECTROPHOTOMÉTRIE EN BIOCHIMIE
La spectrophotométrie est l’une des techniques analytiques les plus utilisées en biochimie. Elle permet d’identifier des molécules à l’aide de leur spectre d’absorption de la
lumière dans le domaine du visible ou du proche ultraviolet. La concentration de composés
connus peut être déterminée en mesurant l’absorption de leurs solutions à une ou plusieurs
longueurs d’onde. De nombreuses réactions enzymatiques peuvent être suivies par spectrophotométrie en observant l’apparition d’un produit ou la disparition d’un substrat.
2. ABSORPTION DES ONDES ÉLECTROMAGNÉTIQUES
Les spectrophotomètres utilisés au laboratoire de biochimie mesurent l’absorption de la
lumière appartenant aux domaines du visible et de l’ultraviolet (UV) ; les longueurs d’onde (l)
s’étendent de 800 à 400 nm pour le visible, et de 400 nm à 220 nm pour le proche ultra-violet.
Ces radiations sont préférentiellement absorbées par les électrons des liaisons p délocalisées.
100 000
10 000
1 000
100
10
1
Longueur d’onde en nm
Visible
Ultraviolet
Infrarouge
Rayons X
100 000
10 000
1 000
100
10
1
Énergie kJ.mol –1
Transitions
rotationnelles
Transitions
vibrationnelles
Transitions
électroniques :
électrons
externes
Transitions
électroniques :
électrons
internes
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