3. A NALYSE DES CONSTITUANTS ET DU FONCTIONNEMENT DES CELLULES
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© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
par rapport au plan de la grille. Comme pour la
coloration négative, le métal déposé autour des
objets fait obstacle aux électrons et on a une vision
directe «en négatif»;on observe en fait une ombre
portée de l’objet, ce qui augmente la sensation de
relief (voir figure 3.12). Cette technique s’est avérée
indispensable pour la visualisation des ADN et
des ARN (voir figures 4.18 et 15.1) ;e lle est également utilisée dans l’étude des surfaces (cryofracture).
1.5.3. M ICROSCOPIE ÀC HAMP PROCHE
( ÀE FFET TUNNEL)
Contrairement aux techniques de microscopie
classiques utilisant des radiations pour observer
un objet, cette méthode très récente, qui permet
seulement d’analyser des surfaces, met en jeu un
phénomène particulier d’interactions entre cellesci et un objet se déplaçant à proximité immédiate.
Lorsqu’une pointe de tungstène extrêmement fine
(terminée par un seul atome) est approchée à une
distance de l’ordre du nm d’une surface conductrice, un faible courant électrique (nommé couranttunnel) passe entre les deux, si une différence de
potentiel existe à leur niveau. Le mouvement de la
pointe est contrôlable verticalement, sur une fraction de nanomètre, et latéralement par des dispositifs dits de «nanodéplacements» (obtenus à l’aide
de céramiques piézoélectriques).
Le balayage assuré par la pointe, ou sonde, est
tel que le courant reste constant (et donc la distance
entre les deux objets), de sorte que ses déplacements reconstituent avec une grande précision les
irrégularités de la surface étudiée. On obtient ainsi
une cartographie très fine des objets (résolution
inférieure à 0,5 nm), mais évidemment sur des surfaces peu importantes. En biologie, la technique
reste réservée à l’analyse de molécules ou d’édifices
supramoléculaires isolés ;c ependant, ses utilisations sont nombreuses en physique, en particulier
en microélectronique.
2. OUTILS ET TECHNIQUES
D’ANALYSE
DU FONCTIONNEMENT
CELLULAIRE
La physiologie cellulaire étudie le fonctionnement des cellules de la manière la plus intégrative
possible, et nous ne pas parlerons donc pas ici des
techniques de dosages enzymatiques simples, qui
relèvent de la biochimie pure. Seules seront décrites
les principales méthodes permettant d’analyser in
vitro ou in vivo les fonctions d’organites purifiés ou
de cellules entières.
2.1. Cultures de cellules
Des cultures clonales de diverses cellules isolées
sont réalisables ;e lles présentent l’avantage considérable de constituer des populations génétiquement et physiologiquement homogènes. Selon les
cas, ces cellules peuvent croître en suspension ou
adhérer sur un support (tapis cellulaire) ;d ans le
premier cas, elles sont récupérées par centrifugation, dans le deuxième, il faut les décrocher par
voie mécanique (grattage) ou chimique pour pouvoir les étudier.
Les micro-organismes procaryotiques (Bactéries,
Cyanobactéries…) ou eucaryotiques unicellulaires
(Protistes : Amoeba, Paramecium, Tetrahymena…,
Algues : Chlamydomonas, Chlorella, Micrasterias…
ou Champignons : levure de bière…) se cultivent
aisément, dans des milieux synthétiques spécifiques parfaitement contrôlés et dans des conditions généralement simples. Ces milieux sont
liquides ou solides, après gélification au moyen de
composés inertes tels que l’agar-agar. La culture in
vitro de cellules d’organismes supérieurs, animaux
ou végétaux, pose davantage de problèmes dans la
mesure où, contrairement aux précédentes, ces cellules sont normalement intégrées au sein d’un
organisme et donc le plus souvent tributaires,
pour leur croissance, d’interactions avec d’autres
cellules. L’intérêt de telles cultures est considérable car elles constituent des systèmes très simplifiés par rapport aux autres sources de cellules
disponibles à partir de ces mêmes organismes.
Les milieux usuels de culture de cellules animales, dont l’origine remonte au début du siècle
(ROUX, 1885 ; H ARRISON, 1909 et C ARREL, 1913), sont
à base de solutions salines additionnées d’un
grand nombre de molécules organiques : sucres,
acides aminés, vitamines…, en raison de leur
caractère hétérotrophe. Ils doivent aussi contenir
des extraits de sérum sanguin (de veau, par
exemple), qui apportent en très faible concentration des facteurs de croissance indispensables à la
multiplication cellulaire (voir chapitre 13). Des
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© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
par rapport au plan de la grille. Comme pour la
coloration négative, le métal déposé autour des
objets fait obstacle aux électrons et on a une vision
directe «en négatif»;on observe en fait une ombre
portée de l’objet, ce qui augmente la sensation de
relief (voir figure 3.12). Cette technique s’est avérée
indispensable pour la visualisation des ADN et
des ARN (voir figures 4.18 et 15.1) ;e lle est également utilisée dans l’étude des surfaces (cryofracture).
1.5.3. M ICROSCOPIE ÀC HAMP PROCHE
( ÀE FFET TUNNEL)
Contrairement aux techniques de microscopie
classiques utilisant des radiations pour observer
un objet, cette méthode très récente, qui permet
seulement d’analyser des surfaces, met en jeu un
phénomène particulier d’interactions entre cellesci et un objet se déplaçant à proximité immédiate.
Lorsqu’une pointe de tungstène extrêmement fine
(terminée par un seul atome) est approchée à une
distance de l’ordre du nm d’une surface conductrice, un faible courant électrique (nommé couranttunnel) passe entre les deux, si une différence de
potentiel existe à leur niveau. Le mouvement de la
pointe est contrôlable verticalement, sur une fraction de nanomètre, et latéralement par des dispositifs dits de «nanodéplacements» (obtenus à l’aide
de céramiques piézoélectriques).
Le balayage assuré par la pointe, ou sonde, est
tel que le courant reste constant (et donc la distance
entre les deux objets), de sorte que ses déplacements reconstituent avec une grande précision les
irrégularités de la surface étudiée. On obtient ainsi
une cartographie très fine des objets (résolution
inférieure à 0,5 nm), mais évidemment sur des surfaces peu importantes. En biologie, la technique
reste réservée à l’analyse de molécules ou d’édifices
supramoléculaires isolés ;c ependant, ses utilisations sont nombreuses en physique, en particulier
en microélectronique.
2. OUTILS ET TECHNIQUES
D’ANALYSE
DU FONCTIONNEMENT
CELLULAIRE
La physiologie cellulaire étudie le fonctionnement des cellules de la manière la plus intégrative
possible, et nous ne pas parlerons donc pas ici des
techniques de dosages enzymatiques simples, qui
relèvent de la biochimie pure. Seules seront décrites
les principales méthodes permettant d’analyser in
vitro ou in vivo les fonctions d’organites purifiés ou
de cellules entières.
2.1. Cultures de cellules
Des cultures clonales de diverses cellules isolées
sont réalisables ;e lles présentent l’avantage considérable de constituer des populations génétiquement et physiologiquement homogènes. Selon les
cas, ces cellules peuvent croître en suspension ou
adhérer sur un support (tapis cellulaire) ;d ans le
premier cas, elles sont récupérées par centrifugation, dans le deuxième, il faut les décrocher par
voie mécanique (grattage) ou chimique pour pouvoir les étudier.
Les micro-organismes procaryotiques (Bactéries,
Cyanobactéries…) ou eucaryotiques unicellulaires
(Protistes : Amoeba, Paramecium, Tetrahymena…,
Algues : Chlamydomonas, Chlorella, Micrasterias…
ou Champignons : levure de bière…) se cultivent
aisément, dans des milieux synthétiques spécifiques parfaitement contrôlés et dans des conditions généralement simples. Ces milieux sont
liquides ou solides, après gélification au moyen de
composés inertes tels que l’agar-agar. La culture in
vitro de cellules d’organismes supérieurs, animaux
ou végétaux, pose davantage de problèmes dans la
mesure où, contrairement aux précédentes, ces cellules sont normalement intégrées au sein d’un
organisme et donc le plus souvent tributaires,
pour leur croissance, d’interactions avec d’autres
cellules. L’intérêt de telles cultures est considérable car elles constituent des systèmes très simplifiés par rapport aux autres sources de cellules
disponibles à partir de ces mêmes organismes.
Les milieux usuels de culture de cellules animales, dont l’origine remonte au début du siècle
(ROUX, 1885 ; H ARRISON, 1909 et C ARREL, 1913), sont
à base de solutions salines additionnées d’un
grand nombre de molécules organiques : sucres,
acides aminés, vitamines…, en raison de leur
caractère hétérotrophe. Ils doivent aussi contenir
des extraits de sérum sanguin (de veau, par
exemple), qui apportent en très faible concentration des facteurs de croissance indispensables à la
multiplication cellulaire (voir chapitre 13). Des