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B IOLOGIE CELLULAIRE
2.5. Te chniques d’observation
des formes et des surfaces
2.5.1. C OLORATION NÉGATIVE
ET OMBRAGE MÉTALLIQUE
La coloration négative s’applique à des objets
de très petites dimensions, de forme relativement
simple (molécules, Virus ou éléments cellulaires
isolés : organites ou fragments d’organites). Elle
permet de voir, en microscopie électronique à
transmission, de très fins détails que les coupes ne
permettent pas de visualiser, en particulier dans le
cas des structures fibreuses (protofilaments protéiques, flagelles, queue de certains Virus…).
L’ombrage métallique s’applique aux mêmes
objets, mais le principe est un peu différent et les
images obtenues sont plus empâtées que dans le
cas du protocole précédent. Il permet, en particulier, de visualiser de façon simple les molécules
d’acides nucléiques. Il constitue également une
étape dans le protocole de cryofracture ; ces deux
techniques sont détaillées dans le chapitre 3.
2.5.2. C RYOFRACTURE
La cryofracture est une technique fondamentalement différente des deux précédentes, qui perLa technique histologique en microscopie électronique
E NCARTT ECHNIQUE
1. Fixation
Les fixateurs classiques ne suffisent pas car ils
tendent à coaguler les protéines et à détruire les
structures fines. Il faut utiliser ici des agents chimiques qui réalisent des pontages entre les molécules voisines, plus qu’ils ne les dénaturent ; cette
fixation «en douceur» stabilise les structures
auxquelles elles appartiennent :
–le permanganate de potassium assure une
excellente conservation des membranes lipoprotéiques, mais les structures cellulaires contenant des acides nucléiques sont très mal fixées ;
–le tétroxyde d’osmium se comporte comme le
précédent, mais il pénètre mal dans les cellules ;
–le glutaraldéhyde pénètre bien dans les cellules,
fixe efficacement de nombreuses structures,
sauf les membranes.
De fait, on combine les avantages des différents
fixateurs en réalisant une double fixation : un
traitement au glutaraldéhyde suivi d’un traitement au tétroxyde d’osmium.
2. Inclusion en résine
Le principe est le même que pour l’histologie
classique, à la différence près que la déshydratation préalable doit se terminer dans un solvant
de la résine utilisée pour l’inclusion. Les milieux
d’inclusion utilisés sont souvent des résines de la
famille des araldites, qui polymérisent à chaud
en présence d’un catalyseur. On obtient des
petits blocs solides et très durs, incluant et imprégnant l’échantillon à analyser ; la dureté de ce
matériel permet d’obtenir des coupes extrêmement fines et régulières. On utilise aussi des
résines hydrosolubles pouvant être éliminées des
coupes, ce qui autorise des expériences d’immunocytochimie en microscopie électronique.
3. Coupe : ultramicrotomie
Les coupes ultrafines sont réalisées grâce à des
couteaux de verre ou de diamant très affutés. Le
problème technique de l’avance régulière et surtout très progressive du porte-objet devant le
couteau est résolu par la mise au point de systèmes basés, par exemple, sur la dilatation d’un
axe métallique (avance thermique). Les coupes,
de très faible taille (moins de 0,5 mm de côté) et
très fines, sont invisibles à l’œil nu et difficilement manipulables sans l’aide d’une loupe. Le
couteau est en fait muni d’une petite cuvette
contenant de l’eau à la surface de laquelle les
coupes flottent. Celles-ci sont récupérées sur des
grilles de 3 à 4 mm de diamètre, à mailles très
fines, qui servent en fait de porte-objet et seront
introduites dans la colonne du microscope.
4. «Coloration»
Cette étape consiste en un simple renforcement
des contrastes : on parle de «coloration positive».
Certains atomes de métaux lourds se fixent sélectivement sur diverses structures cellulaires, fixation qui arrête efficacement les électrons à leur
niveau. Le résultat est un meilleur contraste des
images. On utilise pour cela des solutions d’acétate d’uranyle ou de citrate de plomb et on fait
flotter quelque temps les grilles portant les
coupes sur des gouttes de ces substances.
B IOLOGIE CELLULAIRE
2.5. Te chniques d’observation
des formes et des surfaces
2.5.1. C OLORATION NÉGATIVE
ET OMBRAGE MÉTALLIQUE
La coloration négative s’applique à des objets
de très petites dimensions, de forme relativement
simple (molécules, Virus ou éléments cellulaires
isolés : organites ou fragments d’organites). Elle
permet de voir, en microscopie électronique à
transmission, de très fins détails que les coupes ne
permettent pas de visualiser, en particulier dans le
cas des structures fibreuses (protofilaments protéiques, flagelles, queue de certains Virus…).
L’ombrage métallique s’applique aux mêmes
objets, mais le principe est un peu différent et les
images obtenues sont plus empâtées que dans le
cas du protocole précédent. Il permet, en particulier, de visualiser de façon simple les molécules
d’acides nucléiques. Il constitue également une
étape dans le protocole de cryofracture ; ces deux
techniques sont détaillées dans le chapitre 3.
2.5.2. C RYOFRACTURE
La cryofracture est une technique fondamentalement différente des deux précédentes, qui perLa technique histologique en microscopie électronique
E NCARTT ECHNIQUE
1. Fixation
Les fixateurs classiques ne suffisent pas car ils
tendent à coaguler les protéines et à détruire les
structures fines. Il faut utiliser ici des agents chimiques qui réalisent des pontages entre les molécules voisines, plus qu’ils ne les dénaturent ; cette
fixation «en douceur» stabilise les structures
auxquelles elles appartiennent :
–le permanganate de potassium assure une
excellente conservation des membranes lipoprotéiques, mais les structures cellulaires contenant des acides nucléiques sont très mal fixées ;
–le tétroxyde d’osmium se comporte comme le
précédent, mais il pénètre mal dans les cellules ;
–le glutaraldéhyde pénètre bien dans les cellules,
fixe efficacement de nombreuses structures,
sauf les membranes.
De fait, on combine les avantages des différents
fixateurs en réalisant une double fixation : un
traitement au glutaraldéhyde suivi d’un traitement au tétroxyde d’osmium.
2. Inclusion en résine
Le principe est le même que pour l’histologie
classique, à la différence près que la déshydratation préalable doit se terminer dans un solvant
de la résine utilisée pour l’inclusion. Les milieux
d’inclusion utilisés sont souvent des résines de la
famille des araldites, qui polymérisent à chaud
en présence d’un catalyseur. On obtient des
petits blocs solides et très durs, incluant et imprégnant l’échantillon à analyser ; la dureté de ce
matériel permet d’obtenir des coupes extrêmement fines et régulières. On utilise aussi des
résines hydrosolubles pouvant être éliminées des
coupes, ce qui autorise des expériences d’immunocytochimie en microscopie électronique.
3. Coupe : ultramicrotomie
Les coupes ultrafines sont réalisées grâce à des
couteaux de verre ou de diamant très affutés. Le
problème technique de l’avance régulière et surtout très progressive du porte-objet devant le
couteau est résolu par la mise au point de systèmes basés, par exemple, sur la dilatation d’un
axe métallique (avance thermique). Les coupes,
de très faible taille (moins de 0,5 mm de côté) et
très fines, sont invisibles à l’œil nu et difficilement manipulables sans l’aide d’une loupe. Le
couteau est en fait muni d’une petite cuvette
contenant de l’eau à la surface de laquelle les
coupes flottent. Celles-ci sont récupérées sur des
grilles de 3 à 4 mm de diamètre, à mailles très
fines, qui servent en fait de porte-objet et seront
introduites dans la colonne du microscope.
4. «Coloration»
Cette étape consiste en un simple renforcement
des contrastes : on parle de «coloration positive».
Certains atomes de métaux lourds se fixent sélectivement sur diverses structures cellulaires, fixation qui arrête efficacement les électrons à leur
niveau. Le résultat est un meilleur contraste des
images. On utilise pour cela des solutions d’acétate d’uranyle ou de citrate de plomb et on fait
flotter quelque temps les grilles portant les
coupes sur des gouttes de ces substances.