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B IOLOGIE CELLULAIRE
biologiques. On a ainsi mis en évidence des structures fibreuses orientées au sein d’édifices supramoléculaires tels les fuseaux de division
(microtubules), les parois des cellules végétales
(cellulose), les fibres musculaires striées (myofibrilles de myosine et d’actine), les grains d’amidon…
Ces dispositifs sont d’un intérêt considérable car
ils autorisent l’observation de phénomènes vitaux
de longue durée, tels que la division cellulaire, les
mouvements cellulaires ou intracellulaires d’organites ou le développement embryonnaire précoce.
Leur utilisation, combinée à celle du microcinéma,
a apporté des informations capitales sur nombre
de processus biologiques.
2.3.3. L IMITES DE LA TECHNIQUE
Malgré toutes ces améliorations techniques,
l’observation vitale n’a que des possibilités limitées. Elle ne permet d’étudier que des cellules isolées, ce qui restreint beaucoup le champ
d’analyse ; la fragilité des structures cellulaires est,
dans de nombreux cas, très préjudiciable à des
observations prolongées, dont la validité devient
progressivement sujette à caution. Ce constat a
conduit très tôt les biologistes à chercher les
moyens de «figer» les structures cellulaires, en
particulier celles des tissus massifs, afin d’en obtenir des sections fines et transparentes, aisément
colorables et observables à loisir. L’origine de ces
techniques remonte à la fin du siècle dernier ; leur
ensemble constitue, pour la microscopie photonique, l’histologie classique, dans la mesure où
elles ont d’abord permis l’analyse précise des tissus, avant celle des cellules.
2.4. Te chniques de l’histologie classique
et électronique
2.4.1. H ISTOLOGIE CLASSIQUE
Lorsque le matériel biologique est massif (tissus
animaux ou végétaux : foie, cerveau, muscle…, ou
tige, feuille, racine…), il faut préalablement le
débiter en tranches fines et régulières, qui seront
ensuite colorées. Ceci nécessite de nombreuses
opérations avant d’arriver au stade de la préparation microscopique, telles que celles que l’on a
l’habitude d’observer. Les étapes de ce protocole
sont les suivantes.
•La fixation a pour but de tuer les cellules tout
en modifiant le moins possible leurs structures
internes. On utilise à cet effet des mélanges variés,
empiriquement mis au point, contenant des substances connues pour dénaturer et coaguler essentiellement les protéines : acides, alcools, aldéhydes,
certains sels… Ces fixateurs, dits coagulants, doivent être adaptés à la nature du matériel biologique analysé et au type de coloration employé
ultérieurement ; il en existe un nombre considérable. Une fois la fixation achevée, le matériel doit
être abondamment rincé à l’eau pour éliminer le
fixateur qui pourrait détériorer la matière organique ou interférer avec les étapes suivantes.
•La déshydratation a pour but d’éliminer l’eau
de l’échantillon et de la remplacer par un solvant
du milieu utilisé pour l’inclusion ; elle consiste en
une série de bains dans des alcools de plus en plus
concentrés. Cette opération doit être progressive
pour que la substitution n’entraîne pas de déformation des tissus. Un dernier bain est réalisé dans
un mélange alcool/solvant organique du milieu
d’inclusion, pour arriver enfin à avoir l’échantillon
dans ce solvant pur : xylène, toluène…
•L’ inclusion a pour objectif d’imprégner totalement les cellules d’une substance durcissante,
qui permettra une coupe fine et régulière. Cette
substance, dont les molécules remplacent en fait
les molécules d’eau initiales, est souvent la paraffine qui est liquide à 60 °C et dure à la température
ambiante ; soluble dans les solvants cités plus
haut, elle pénètre très aisément dans les tissus.
Après plusieurs bains à 60 °C et durcissement de
la paraffine, on obtient un «bloc» qui pourra être
correctement coupé et qui sert aussi de moyen de
stockage des échantillons.
•La coupe a pour but de réaliser des sections
fines (de 2 à 10 µ m d’épaisseur) et transparentes
de l’objet inclus. On utilise un microtome, muni
d’un rasoir métallique et d’un système d’avance
mécanique du porte-objet, qui donne des coupes
sériées ; celles-ci sont collées avec une solution de
gélatine sur des lames de verre, séchées et déparaffinées avec du xylène ou du toluène. Seule la
matière organique de la coupe subsiste sur la lame.
•La coloration permet de teinter de façon différentielle les divers territoires de l’échantillon biologique. De très nombreuses colorations plus ou
moins spécifiques ont été empiriquement mises au
point vers la fin du XIX
e
et au début du XX
e
siècles
(période prospère de la chimie organique des colorants). Tous ces colorants étant hydrosolubles (car
B IOLOGIE CELLULAIRE
biologiques. On a ainsi mis en évidence des structures fibreuses orientées au sein d’édifices supramoléculaires tels les fuseaux de division
(microtubules), les parois des cellules végétales
(cellulose), les fibres musculaires striées (myofibrilles de myosine et d’actine), les grains d’amidon…
Ces dispositifs sont d’un intérêt considérable car
ils autorisent l’observation de phénomènes vitaux
de longue durée, tels que la division cellulaire, les
mouvements cellulaires ou intracellulaires d’organites ou le développement embryonnaire précoce.
Leur utilisation, combinée à celle du microcinéma,
a apporté des informations capitales sur nombre
de processus biologiques.
2.3.3. L IMITES DE LA TECHNIQUE
Malgré toutes ces améliorations techniques,
l’observation vitale n’a que des possibilités limitées. Elle ne permet d’étudier que des cellules isolées, ce qui restreint beaucoup le champ
d’analyse ; la fragilité des structures cellulaires est,
dans de nombreux cas, très préjudiciable à des
observations prolongées, dont la validité devient
progressivement sujette à caution. Ce constat a
conduit très tôt les biologistes à chercher les
moyens de «figer» les structures cellulaires, en
particulier celles des tissus massifs, afin d’en obtenir des sections fines et transparentes, aisément
colorables et observables à loisir. L’origine de ces
techniques remonte à la fin du siècle dernier ; leur
ensemble constitue, pour la microscopie photonique, l’histologie classique, dans la mesure où
elles ont d’abord permis l’analyse précise des tissus, avant celle des cellules.
2.4. Te chniques de l’histologie classique
et électronique
2.4.1. H ISTOLOGIE CLASSIQUE
Lorsque le matériel biologique est massif (tissus
animaux ou végétaux : foie, cerveau, muscle…, ou
tige, feuille, racine…), il faut préalablement le
débiter en tranches fines et régulières, qui seront
ensuite colorées. Ceci nécessite de nombreuses
opérations avant d’arriver au stade de la préparation microscopique, telles que celles que l’on a
l’habitude d’observer. Les étapes de ce protocole
sont les suivantes.
•La fixation a pour but de tuer les cellules tout
en modifiant le moins possible leurs structures
internes. On utilise à cet effet des mélanges variés,
empiriquement mis au point, contenant des substances connues pour dénaturer et coaguler essentiellement les protéines : acides, alcools, aldéhydes,
certains sels… Ces fixateurs, dits coagulants, doivent être adaptés à la nature du matériel biologique analysé et au type de coloration employé
ultérieurement ; il en existe un nombre considérable. Une fois la fixation achevée, le matériel doit
être abondamment rincé à l’eau pour éliminer le
fixateur qui pourrait détériorer la matière organique ou interférer avec les étapes suivantes.
•La déshydratation a pour but d’éliminer l’eau
de l’échantillon et de la remplacer par un solvant
du milieu utilisé pour l’inclusion ; elle consiste en
une série de bains dans des alcools de plus en plus
concentrés. Cette opération doit être progressive
pour que la substitution n’entraîne pas de déformation des tissus. Un dernier bain est réalisé dans
un mélange alcool/solvant organique du milieu
d’inclusion, pour arriver enfin à avoir l’échantillon
dans ce solvant pur : xylène, toluène…
•L’ inclusion a pour objectif d’imprégner totalement les cellules d’une substance durcissante,
qui permettra une coupe fine et régulière. Cette
substance, dont les molécules remplacent en fait
les molécules d’eau initiales, est souvent la paraffine qui est liquide à 60 °C et dure à la température
ambiante ; soluble dans les solvants cités plus
haut, elle pénètre très aisément dans les tissus.
Après plusieurs bains à 60 °C et durcissement de
la paraffine, on obtient un «bloc» qui pourra être
correctement coupé et qui sert aussi de moyen de
stockage des échantillons.
•La coupe a pour but de réaliser des sections
fines (de 2 à 10 µ m d’épaisseur) et transparentes
de l’objet inclus. On utilise un microtome, muni
d’un rasoir métallique et d’un système d’avance
mécanique du porte-objet, qui donne des coupes
sériées ; celles-ci sont collées avec une solution de
gélatine sur des lames de verre, séchées et déparaffinées avec du xylène ou du toluène. Seule la
matière organique de la coupe subsiste sur la lame.
•La coloration permet de teinter de façon différentielle les divers territoires de l’échantillon biologique. De très nombreuses colorations plus ou
moins spécifiques ont été empiriquement mises au
point vers la fin du XIX
e
et au début du XX
e
siècles
(période prospère de la chimie organique des colorants). Tous ces colorants étant hydrosolubles (car