402 B IOLOGIE CELLULAIRE
phase S n’est donc pas actif sur des cellules ayant
déjà dupliqué leur ADN. On montre de la même
façon que les cellules en G2 ne contiennent plus
cet activateur, pas plus qu’elles ne contiennent
d’inhibiteur de cette synthèse.
Lorsqu’on fait fusionner deux cellules dont
l’une est en phase M, la seconde voit son noyau
«essayer», quelle que soit sa position dans le cycle,
de mettre en place des chromosomes de type prophasique. Si ces cellules sont en G1, elles fabriquent des chromosomes constitués d’une seule
chromatide, contrairement à la situation normale
où ceci se produit après la phase S;la condensation
prématurée des chromosomes a lieu également
dans des noyaux en S ou en G2. Ces résultats montrent l’existence, au sein du cytoplasme des cellules en mitose, d’un puissant facteur d’entrée en
mitose, agissant indépendamment des événements de réplication de l’ADN lui-même. Ce
second facteur activateur a été nommé MPF (facteur promoteur de la phase M).
• Expériences d’injections dans les ovocytes
L’identification du MPF a été grandement facilitée grâce à l’utilisation de cellules géantes comme
les œufs de certains Invertébrés (oursin, étoile de
mer) ou Vertébrés (Amphibiens). D’une part, on
peut obtenir de grandes quantités de cellules synchronisées en phase G2 de la première division de
la méiose (ovocytes) ou en phase M (ovocytes en
cours de maturation ou ovules pondus non fécondés), d’autre part, ces cellules ont une taille telle
que l’on peut prélever avec des micro-seringues
une petite quantité de leur cytoplasme et le réinjecter à d’autres cellules à des stades différents.
Les résultats obtenus sont identiques à ceux
décrits plus haut, à savoir que ces différents types
de cellules en phase M contiennent le MPF (voir
figure 13.4). De même, on montre que ce facteur
activateur de la division est présent de façon
cyclique au cours des premiers stades embryonnaires, son activité augmentant au début de chaque
mitose et retombant entre deux mitoses.
Une information importante a aussi été fournie
par ces expériences avec les ovocytes : la division
du cytoplasme et l’activité cyclique du MPF peuvent se dérouler en l’absence de noyaux, ce qui
témoigne de l’existence d’une horloge biochimique interne à la cellule, indépendante de la
transcription des gènes. On a aussi montré avec ce
système modèle que le MPF est une molécule universelle car des extraits de cellules d’Invertébrés
variés, de Vertébrés et même de levures, sont
capables d’entraîner des ovocytes d’amphibiens en
phase M. La purification de ce composé a été obtenue en 1989, et on connaît maintenant le principe
de son fonctionnement, qui sera donné plus loin.
1.2.2. D ONNÉES DE LA GÉNÉTIQUE ET DE LA BIOLOGIE
MOLÉCULAIRE : LES MUTANTS DU CYCLE
CHEZ LES LEVURES
Une autre approche très féconde a rejoint l’analyse cellulaire qui vient d’être décrite ; elle a
consisté à sélectionner des mutants conditionnels
du cycle de division chez les levures. Deux espèces
ont été utilisées à cet effet : Saccharomyces cerevisiae
et Schizosaccharomyces pombe ; la première se divise
par bourgeonnement, tandis que la seconde se
multiplie de façon classique, par allongement suivi
de coupure symétrique. Toutes deux peuvent être
propagées en phase haploïde, ce qui permet la
sélection de mutations récessives. La recherche de
mutants du cycle implique la sélection de mutants
conditionnels car, normalement, les mutations qui
bloquent le cycle empêchent toute reproduction et
conduisent à la perte de la souche (létalité). L’intérêt de ces organismes réside aussi dans le fait que
certains stades de leur cycle sont bien identifiables
par leur morphologie, et il a ainsi été possible,
après mutagenèse, de cribler visuellement des
mutants bloqués dans leur développement.
Dans chaque espèce, plus de 50 gènes concernant le cycle ont ainsi été mis en évidence, dont les
produits ont été identifiés au plan biochimique.
Plusieurs protéines banales : enzymes de fourniture des précurseurs, ADN polymérase, ligase,
etc., conduisent à l’arrêt des cellules en phase S
lorsqu’elles sont mutées. À côté d’elles cependant,
ont été identifiées des molécules jouant un vrai
rôle de contrôle du cycle : protéines-kinases, facteurs de transcription, cyclines, etc., dont nous verrons l’importance plus loin. Toutes les mutations
isolées concernent une dizaine d’événements clefs
et se répartissent en trois groupes permettant de
définir trois séquences principales déterminant le
cycle : les séquences cytoplasmique, chromosomique et centrosomique (bien qu’il n’y ait pas de
centrosome classique chez la levure). Ces voies
sont relativement indépendantes les unes des
autres, mais au sein de chacune d’elles les événements sont bien ordonnés et ne peuvent se dérouler que si les précédents sont effectués.
phase S n’est donc pas actif sur des cellules ayant
déjà dupliqué leur ADN. On montre de la même
façon que les cellules en G2 ne contiennent plus
cet activateur, pas plus qu’elles ne contiennent
d’inhibiteur de cette synthèse.
Lorsqu’on fait fusionner deux cellules dont
l’une est en phase M, la seconde voit son noyau
«essayer», quelle que soit sa position dans le cycle,
de mettre en place des chromosomes de type prophasique. Si ces cellules sont en G1, elles fabriquent des chromosomes constitués d’une seule
chromatide, contrairement à la situation normale
où ceci se produit après la phase S;la condensation
prématurée des chromosomes a lieu également
dans des noyaux en S ou en G2. Ces résultats montrent l’existence, au sein du cytoplasme des cellules en mitose, d’un puissant facteur d’entrée en
mitose, agissant indépendamment des événements de réplication de l’ADN lui-même. Ce
second facteur activateur a été nommé MPF (facteur promoteur de la phase M).
• Expériences d’injections dans les ovocytes
L’identification du MPF a été grandement facilitée grâce à l’utilisation de cellules géantes comme
les œufs de certains Invertébrés (oursin, étoile de
mer) ou Vertébrés (Amphibiens). D’une part, on
peut obtenir de grandes quantités de cellules synchronisées en phase G2 de la première division de
la méiose (ovocytes) ou en phase M (ovocytes en
cours de maturation ou ovules pondus non fécondés), d’autre part, ces cellules ont une taille telle
que l’on peut prélever avec des micro-seringues
une petite quantité de leur cytoplasme et le réinjecter à d’autres cellules à des stades différents.
Les résultats obtenus sont identiques à ceux
décrits plus haut, à savoir que ces différents types
de cellules en phase M contiennent le MPF (voir
figure 13.4). De même, on montre que ce facteur
activateur de la division est présent de façon
cyclique au cours des premiers stades embryonnaires, son activité augmentant au début de chaque
mitose et retombant entre deux mitoses.
Une information importante a aussi été fournie
par ces expériences avec les ovocytes : la division
du cytoplasme et l’activité cyclique du MPF peuvent se dérouler en l’absence de noyaux, ce qui
témoigne de l’existence d’une horloge biochimique interne à la cellule, indépendante de la
transcription des gènes. On a aussi montré avec ce
système modèle que le MPF est une molécule universelle car des extraits de cellules d’Invertébrés
variés, de Vertébrés et même de levures, sont
capables d’entraîner des ovocytes d’amphibiens en
phase M. La purification de ce composé a été obtenue en 1989, et on connaît maintenant le principe
de son fonctionnement, qui sera donné plus loin.
1.2.2. D ONNÉES DE LA GÉNÉTIQUE ET DE LA BIOLOGIE
MOLÉCULAIRE : LES MUTANTS DU CYCLE
CHEZ LES LEVURES
Une autre approche très féconde a rejoint l’analyse cellulaire qui vient d’être décrite ; elle a
consisté à sélectionner des mutants conditionnels
du cycle de division chez les levures. Deux espèces
ont été utilisées à cet effet : Saccharomyces cerevisiae
et Schizosaccharomyces pombe ; la première se divise
par bourgeonnement, tandis que la seconde se
multiplie de façon classique, par allongement suivi
de coupure symétrique. Toutes deux peuvent être
propagées en phase haploïde, ce qui permet la
sélection de mutations récessives. La recherche de
mutants du cycle implique la sélection de mutants
conditionnels car, normalement, les mutations qui
bloquent le cycle empêchent toute reproduction et
conduisent à la perte de la souche (létalité). L’intérêt de ces organismes réside aussi dans le fait que
certains stades de leur cycle sont bien identifiables
par leur morphologie, et il a ainsi été possible,
après mutagenèse, de cribler visuellement des
mutants bloqués dans leur développement.
Dans chaque espèce, plus de 50 gènes concernant le cycle ont ainsi été mis en évidence, dont les
produits ont été identifiés au plan biochimique.
Plusieurs protéines banales : enzymes de fourniture des précurseurs, ADN polymérase, ligase,
etc., conduisent à l’arrêt des cellules en phase S
lorsqu’elles sont mutées. À côté d’elles cependant,
ont été identifiées des molécules jouant un vrai
rôle de contrôle du cycle : protéines-kinases, facteurs de transcription, cyclines, etc., dont nous verrons l’importance plus loin. Toutes les mutations
isolées concernent une dizaine d’événements clefs
et se répartissent en trois groupes permettant de
définir trois séquences principales déterminant le
cycle : les séquences cytoplasmique, chromosomique et centrosomique (bien qu’il n’y ait pas de
centrosome classique chez la levure). Ces voies
sont relativement indépendantes les unes des
autres, mais au sein de chacune d’elles les événements sont bien ordonnés et ne peuvent se dérouler que si les précédents sont effectués.