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B IOLOGIE CELLULAIRE
territoire cellulaire précis ; l’utilisation de microscopes à très haute tension permet aussi de pallier
cet inconvénient (voir plus loin).
Outre les coupes, le MET permet d’observer des
répliques (moulages métalliques) obtenues dans
le cadre de la technique de cryofracture (voir chapitre 5), des préparations de molécules, ombrées
de la même façon, ou bien des préparations de
type coloration négative (voir chapitre 3).
2.2. Microscope photoniqueàépifluorescence
Cet appareil permet d’analyser la lumière
réémise par fluorescence par un échantillon éclairé
au moyen d’une lumière de longueur d’onde
appropriée. Les molécules fluorescentes ont la propriété, lorsqu’elles sont éclairées par une lumière
d’une certaine longueur d’onde (qu’elles absorbent), de réémettre une lumière de longueur d’onde
plus élevée (et moins énergétique). De nombreux
composés organiques sont naturellement fluorescents (la chlorophylle, par exemple), mais on utilise surtout en biologie des composés artificiels
servant soit de marqueurs pour détecter des
macromolécules, auxquelles on les a artificiellement associés (pour l’immunofluorescence, par
exemple), soit de substrats dans des réactions
enzymatiques (cytoenzymologie).
Tout composé fluorescent est caractérisé par une
longueur d’onde précise d’excitation maximale et
une longueur d’onde de réémission maximale ; la
fluorescéine, par exemple, a un pic d’absorption
situé entre 450 et 490 nm (bleu) et un pic d’émission situé entre 520 et 560 nm (jaune-vert). Un
microscope à fluorescence est donc équipé d’une
puissante source lumineuse éclairant le plus souvent dans l’ultraviolet (auquel de nombreux colorants de ce genre sont sensibles) et de filtres qui
sélectionnent les longueurs d’onde appropriées de
la lumière avant (excitation) et après (émission)
que l’objet ait été éclairé. Ceci est nécessaire pour
que l’image donnée par la lumière émise ne soit
pas polluée par la lumière excitatrice.
Le microscope généralement utilisé, dit à épifluorescence, n’est pas un microscope à transmission ordinaire car la lumière reçue par l’œil ne
traverse pas l’échantillon observé. En fait, les
lumières excitatrice et réémise passent toutes deux
à travers l’objectif et l’objet étudié est éclairé par
dessus, d’où le nom d’épifluorescence. De nombreux microscopes de ce type sont équipés d’un
dispositif permettant la microscopie confocale.
2.3. Observations vitales
Il s’agit de l’observation d’un matériel vivant
brut ; la nécessité d’utiliser des objets transparents
limite beaucoup le nombre de cellules ou de tissus
directement observables. Les cellules vivant à
l’état isolé, comme les Bactéries ou les Protistes
(Protozoaires, Algues unicellulaires), ou bien les
cellules sanguines ou en culture, sont seules aisément analysables (technique du frottis). De la
même façon, seules des assemblées cellulaires de
faible épaisseur, comme certains épithéliums animaux ou végétaux (unistratifiés, ou présentant un
petit nombre de couches de cellules) sont faciles à
observer. Ces observations se font dans des conditions où les cellules restent vivantes un minimum
de temps, ce qui implique la mise au point de
milieux appropriés et de montages appelés
chambres de survie. Les conditions d’alimentation
des cellules, de température, d’oxygénation, de
pH, doivent être bien contrôlées, et ce d’autant
plus que la durée de l’observation se prolonge.
Une autre difficulté des observations vitales
tient au fait que les cellules ont en général un
contenu transparent et incolore, d’où l’impossibilité
de distinguer les structures internes. Chez les
Végétaux, les chloroplastes ou les chromoplastes
sont naturellement colorés, ainsi que les vacuoles
dans lesquelles des anthocyanes sont accumulées.
Chez les Animaux, la situation est moins favorable,
à l’exception de quelques cas de cellules pigmentaires (mélanocytes). Dans les milieux transparents
incolores, les seules variations sont dues aux différences d’indice de réfraction des divers organites
ou structures ; au sein du noyau, par exemple, le
nucléole a l’aspect d’une sphère brillante, en raison d’une forte réfringence. Divers dispositifs physiques associés au microscope utilisent cette
propriété pour améliorer la lisibilité des images,
sans qu’il soit nécessaire de colorer les cellules
(voir plus loin).
2.3.1. C OLORANTS VITAUX
De nombreuses techniques de coloration, dites
vitales, ont été mises au point, permettant de
visualiser pendant des périodes plus ou moins
B IOLOGIE CELLULAIRE
territoire cellulaire précis ; l’utilisation de microscopes à très haute tension permet aussi de pallier
cet inconvénient (voir plus loin).
Outre les coupes, le MET permet d’observer des
répliques (moulages métalliques) obtenues dans
le cadre de la technique de cryofracture (voir chapitre 5), des préparations de molécules, ombrées
de la même façon, ou bien des préparations de
type coloration négative (voir chapitre 3).
2.2. Microscope photoniqueàépifluorescence
Cet appareil permet d’analyser la lumière
réémise par fluorescence par un échantillon éclairé
au moyen d’une lumière de longueur d’onde
appropriée. Les molécules fluorescentes ont la propriété, lorsqu’elles sont éclairées par une lumière
d’une certaine longueur d’onde (qu’elles absorbent), de réémettre une lumière de longueur d’onde
plus élevée (et moins énergétique). De nombreux
composés organiques sont naturellement fluorescents (la chlorophylle, par exemple), mais on utilise surtout en biologie des composés artificiels
servant soit de marqueurs pour détecter des
macromolécules, auxquelles on les a artificiellement associés (pour l’immunofluorescence, par
exemple), soit de substrats dans des réactions
enzymatiques (cytoenzymologie).
Tout composé fluorescent est caractérisé par une
longueur d’onde précise d’excitation maximale et
une longueur d’onde de réémission maximale ; la
fluorescéine, par exemple, a un pic d’absorption
situé entre 450 et 490 nm (bleu) et un pic d’émission situé entre 520 et 560 nm (jaune-vert). Un
microscope à fluorescence est donc équipé d’une
puissante source lumineuse éclairant le plus souvent dans l’ultraviolet (auquel de nombreux colorants de ce genre sont sensibles) et de filtres qui
sélectionnent les longueurs d’onde appropriées de
la lumière avant (excitation) et après (émission)
que l’objet ait été éclairé. Ceci est nécessaire pour
que l’image donnée par la lumière émise ne soit
pas polluée par la lumière excitatrice.
Le microscope généralement utilisé, dit à épifluorescence, n’est pas un microscope à transmission ordinaire car la lumière reçue par l’œil ne
traverse pas l’échantillon observé. En fait, les
lumières excitatrice et réémise passent toutes deux
à travers l’objectif et l’objet étudié est éclairé par
dessus, d’où le nom d’épifluorescence. De nombreux microscopes de ce type sont équipés d’un
dispositif permettant la microscopie confocale.
2.3. Observations vitales
Il s’agit de l’observation d’un matériel vivant
brut ; la nécessité d’utiliser des objets transparents
limite beaucoup le nombre de cellules ou de tissus
directement observables. Les cellules vivant à
l’état isolé, comme les Bactéries ou les Protistes
(Protozoaires, Algues unicellulaires), ou bien les
cellules sanguines ou en culture, sont seules aisément analysables (technique du frottis). De la
même façon, seules des assemblées cellulaires de
faible épaisseur, comme certains épithéliums animaux ou végétaux (unistratifiés, ou présentant un
petit nombre de couches de cellules) sont faciles à
observer. Ces observations se font dans des conditions où les cellules restent vivantes un minimum
de temps, ce qui implique la mise au point de
milieux appropriés et de montages appelés
chambres de survie. Les conditions d’alimentation
des cellules, de température, d’oxygénation, de
pH, doivent être bien contrôlées, et ce d’autant
plus que la durée de l’observation se prolonge.
Une autre difficulté des observations vitales
tient au fait que les cellules ont en général un
contenu transparent et incolore, d’où l’impossibilité
de distinguer les structures internes. Chez les
Végétaux, les chloroplastes ou les chromoplastes
sont naturellement colorés, ainsi que les vacuoles
dans lesquelles des anthocyanes sont accumulées.
Chez les Animaux, la situation est moins favorable,
à l’exception de quelques cas de cellules pigmentaires (mélanocytes). Dans les milieux transparents
incolores, les seules variations sont dues aux différences d’indice de réfraction des divers organites
ou structures ; au sein du noyau, par exemple, le
nucléole a l’aspect d’une sphère brillante, en raison d’une forte réfringence. Divers dispositifs physiques associés au microscope utilisent cette
propriété pour améliorer la lisibilité des images,
sans qu’il soit nécessaire de colorer les cellules
(voir plus loin).
2.3.1. C OLORANTS VITAUX
De nombreuses techniques de coloration, dites
vitales, ont été mises au point, permettant de
visualiser pendant des périodes plus ou moins