9. S YNTHÈ SE ET ROUTAGE DES PROTÉINES CHEZ LES EUCARYOTES. BIOGENÈ SE DES ORGANITES 253
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
2.3. Mécanismes d’insertion cotraductionnelle
des protéines dans le réticulum rugueux
2.3.1. S YSTÈMES DE TRADUCTION PROTÉIQUE IN VITRO
Il existe, depuis environ 50 ans, des systèmes
acellulaires permettant la synthèse in vitro de protéines, lorsqu’on leur fournit les ARN messagers
purifiés correspondants (voir chapitre 4). Cette
technique est très utilisée en biologie moléculaire
pour caractériser des populations d’ARNm obtenus in vivo ou in vitro ; en biologie cellulaire, elle a
contribué à la compréhension des mécanismes de
routage des protéines chez les Eucaryotes (voir
plus loin). Ces systèmes sont constitués d’extraits
obtenus à partir de tissus connus pour être très
actifs en synthèse protéique. Les plus classiques
sont constitués, soit de lysats de réticulocytes
(jeunes globules rouges sans noyau ni réticulum)
de poulet ou de lapin, soit de surnageants d’homogénats de germes de blé. Ces extraits contiennent
tous les ingrédients nécessaires à la traduction :
ribosomes libres, enzymes d’activation, ARNt, facteurs protéiques divers ; ils sont enrichis en acides
aminés (dont un ou deux sont radiomarqués ; en
général la leucine ou la méthionine) et en un système de fourniture d’ATP (phosphocréatine/
kinase) ; ils sont enfin traités par une ARNase
diluée qui détruit spécifiquement les ARNm endogènes, afin d’obtenir un bruit de fond minimal. Il
suffit d’ajouter les ARNm purifiés pour faire
démarrer la synthèse des protéines, que l’on peut
ensuite précipiter puis analyser aisément par électrophorèse suivie d’autoradiographie ; celles-ci
reflètent en quantité et en qualité la population des
ARNm introduite dans le tube.
2.3.2. U TILISATION DES MICROSOMES.
M ISE EN ÉVIDENCE DU RÔLE DE LA SÉQUENCESIGNAL
Les chercheurs disposent de préparations de
microsomes purifiés à partir de pancréas, qui peuvent être ajoutés aux systèmes de traduction in
vitro classiques décrits précédemment. Il est ainsi
possible de tester l’influence de leur présence (et
donc de celle du RR) sur les mécanismes de la traduction. Les premières expériences décisives ont
été conduites au début des années 70, date à
laquelle des ARNm purifiés et actifs ont été extraits de cellules sécrétrices spécialisées dans la fabrication d’un nombre limité de protéines connues,
ce qui permettait d’identifier aisément les messagers correspondants (exemples : les chaînes
légères des immunoglobulines, sécrétées par des
cellules cancéreuses de myélomes de souris, ou la
prolactine, sécrétée par l’hypophyse).
L’observation de base est la suivante : lorsque
de tels ARNm purifiés sont utilisés dans des systèmes simples de synthèse protéique in vitro, qui
n’utilisent que des ribosomes libres (type réticulocyte), on obtient toujours une chaîne polypeptidique plus longue que celle normalement faite in
vivo. Dans tous les cas analysés, la différence de
longueur porte sur une séquence de tête (N-terminale) constituée de quelques dizaines d’acides
aminés. Par ailleurs, il suffit d’ajouter au système,
dès le début de l’expérience, un certain volume de
microsomes rugueux purifiés pour qu’on obtienne
la forme normale, courte (appelée forme mature),
de la protéine. Si on ajoute en outre au milieu réactionnel, en fin d’expérience, une protéase (enzyme
digérant les protéines), on constate que la protéine
néosynthétisée s’avère résistante à une attaque
protéolytique ; dans les mêmes conditions, la forme
longue synthétisée en l’absence de microsomes est
sensible à la protéase. Enfin, si la même expérience
de protéolyse est faite en présence d’un détergent,
la forme courte fabriquée en présence de microsomes devient sensible.
Ces expériences prouvent que la protéine synthétisée selon ce mode est injectée dans les vésicules microsomales en même temps qu’elle est
polymérisée par les ribosomes : c’est le processus
dit d’insertion cotraductionnelle, qui caractérise
le fonctionnement du réticulum rugueux (voir
figure 9.6). Il a également été montré que le peptide
de tête, éliminé après la synthèse, sert de moyen
de reconnaissance pour diriger les protéines sécrétées vers les membranes du RR ; c’est la théorie du
signal, formulée vers 1975, qui sera généralisée à
tous les types d’aiguillage de protéines dans la cellule, comme on le verra plus loin. La caractéristique commune à toutes les séquences-signal
trouvées dans les formes immatures des protéines
sécrétées (ainsi que celles des protéines membranaires et lysosomales) est qu’elles renferment de
quatre à douze résidus hydrophobes à la suite. Il
n’existe cependant pas de réelle homologie de
séquence entre elles, mais simplement une ressemblance au plan physicochimique.
La preuve directe du rôle de cette séquencesignal a été apportée par les techniques récentes
du génie génétique. On peut réaliser in vitro des
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
2.3. Mécanismes d’insertion cotraductionnelle
des protéines dans le réticulum rugueux
2.3.1. S YSTÈMES DE TRADUCTION PROTÉIQUE IN VITRO
Il existe, depuis environ 50 ans, des systèmes
acellulaires permettant la synthèse in vitro de protéines, lorsqu’on leur fournit les ARN messagers
purifiés correspondants (voir chapitre 4). Cette
technique est très utilisée en biologie moléculaire
pour caractériser des populations d’ARNm obtenus in vivo ou in vitro ; en biologie cellulaire, elle a
contribué à la compréhension des mécanismes de
routage des protéines chez les Eucaryotes (voir
plus loin). Ces systèmes sont constitués d’extraits
obtenus à partir de tissus connus pour être très
actifs en synthèse protéique. Les plus classiques
sont constitués, soit de lysats de réticulocytes
(jeunes globules rouges sans noyau ni réticulum)
de poulet ou de lapin, soit de surnageants d’homogénats de germes de blé. Ces extraits contiennent
tous les ingrédients nécessaires à la traduction :
ribosomes libres, enzymes d’activation, ARNt, facteurs protéiques divers ; ils sont enrichis en acides
aminés (dont un ou deux sont radiomarqués ; en
général la leucine ou la méthionine) et en un système de fourniture d’ATP (phosphocréatine/
kinase) ; ils sont enfin traités par une ARNase
diluée qui détruit spécifiquement les ARNm endogènes, afin d’obtenir un bruit de fond minimal. Il
suffit d’ajouter les ARNm purifiés pour faire
démarrer la synthèse des protéines, que l’on peut
ensuite précipiter puis analyser aisément par électrophorèse suivie d’autoradiographie ; celles-ci
reflètent en quantité et en qualité la population des
ARNm introduite dans le tube.
2.3.2. U TILISATION DES MICROSOMES.
M ISE EN ÉVIDENCE DU RÔLE DE LA SÉQUENCESIGNAL
Les chercheurs disposent de préparations de
microsomes purifiés à partir de pancréas, qui peuvent être ajoutés aux systèmes de traduction in
vitro classiques décrits précédemment. Il est ainsi
possible de tester l’influence de leur présence (et
donc de celle du RR) sur les mécanismes de la traduction. Les premières expériences décisives ont
été conduites au début des années 70, date à
laquelle des ARNm purifiés et actifs ont été extraits de cellules sécrétrices spécialisées dans la fabrication d’un nombre limité de protéines connues,
ce qui permettait d’identifier aisément les messagers correspondants (exemples : les chaînes
légères des immunoglobulines, sécrétées par des
cellules cancéreuses de myélomes de souris, ou la
prolactine, sécrétée par l’hypophyse).
L’observation de base est la suivante : lorsque
de tels ARNm purifiés sont utilisés dans des systèmes simples de synthèse protéique in vitro, qui
n’utilisent que des ribosomes libres (type réticulocyte), on obtient toujours une chaîne polypeptidique plus longue que celle normalement faite in
vivo. Dans tous les cas analysés, la différence de
longueur porte sur une séquence de tête (N-terminale) constituée de quelques dizaines d’acides
aminés. Par ailleurs, il suffit d’ajouter au système,
dès le début de l’expérience, un certain volume de
microsomes rugueux purifiés pour qu’on obtienne
la forme normale, courte (appelée forme mature),
de la protéine. Si on ajoute en outre au milieu réactionnel, en fin d’expérience, une protéase (enzyme
digérant les protéines), on constate que la protéine
néosynthétisée s’avère résistante à une attaque
protéolytique ; dans les mêmes conditions, la forme
longue synthétisée en l’absence de microsomes est
sensible à la protéase. Enfin, si la même expérience
de protéolyse est faite en présence d’un détergent,
la forme courte fabriquée en présence de microsomes devient sensible.
Ces expériences prouvent que la protéine synthétisée selon ce mode est injectée dans les vésicules microsomales en même temps qu’elle est
polymérisée par les ribosomes : c’est le processus
dit d’insertion cotraductionnelle, qui caractérise
le fonctionnement du réticulum rugueux (voir
figure 9.6). Il a également été montré que le peptide
de tête, éliminé après la synthèse, sert de moyen
de reconnaissance pour diriger les protéines sécrétées vers les membranes du RR ; c’est la théorie du
signal, formulée vers 1975, qui sera généralisée à
tous les types d’aiguillage de protéines dans la cellule, comme on le verra plus loin. La caractéristique commune à toutes les séquences-signal
trouvées dans les formes immatures des protéines
sécrétées (ainsi que celles des protéines membranaires et lysosomales) est qu’elles renferment de
quatre à douze résidus hydrophobes à la suite. Il
n’existe cependant pas de réelle homologie de
séquence entre elles, mais simplement une ressemblance au plan physicochimique.
La preuve directe du rôle de cette séquencesignal a été apportée par les techniques récentes
du génie génétique. On peut réaliser in vitro des