7. N UTRITION ET CROISSANCE DES CELLULES.U TILISATION DES MÉTABOLITES 185
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
3.1. Mise en évidence expérimentale
des lysosomes : un exemple atypique
De façon inhabituelle dans l’histoire de la biologie cellulaire, ces organites ont été mis en évidence
par des techniques utilisant le fractionnement cellulaire et les tests biochimiques, avant d’avoir été
décrits au plan cytologique. Leur découverte, vers
1950 (C. DE D UVE), s’est faite de la manière suivante. Lorsque l’activité spécifique de la phosphatase acide (voir 3.2.2.) est dosée dans des
homogénats de foie de rat, celle-ci est d’autant
plus élevée que ces derniers sont «maltraités », par
rapport aux précautions habituellement prises
dans les expériences d’enzymologie. Par exemple,
l’homogénéisation dans de l’eau distillée et non
pas dans un milieu osmotiquement équilibré,
l’emploi de détergents, une agitation mécanique
violente, développaient considérablement ( 10)
l’activité enzymatique. De même, des cycles successifs de congélation/décongélation des extraits,
ou des séjours prolongés à 4°C, connus pour altérer les protéines, avaient les mêmes conséquences.
En fait, tous les traitements censés détériorer les
organites avaient un effet stimulant sur cette
enzyme, supposée jusque-là hyaloplasmique. La
conclusion fut que cette activité était sans doute
localisée dans des vésicules encore non identifiées,
dont la destruction libérait le contenu et lui permettait de s’exprimer. Ce phénomène fut ensuite
démontré pour de nombreuses autres activités de
type hydrolases.
Les méthodes du fractionnement cellulaire,
associées à l’utilisation de gradients continus de
saccharose, très résolutifs, ont permis de séparer
– avec difficulté cependant – ces vésicules des mitochondries et des peroxysomes (voir chapitre 10).
Malgré leurs tailles assez différentes, ces trois types
d’organites sédimentent dans les mêmes conditions
de centrifugation différentielle. Le fait qu’ils possèdent des enzymes bien distinctes (enzymes marqueurs) a grandement facilité leur identification
sur les gradients. La nature des enzymes caractéristiques de ces nouveaux organites se prêtant bien
à la mise au point de tests cytoenzymologiques, y
compris en microscopie électronique (voir encart
suivant), ceux-ci furent rapidement visualisés au
sein de toutes les cellules eucaryotiques.
3.2. Ultrastructure et composition chimique
3.2.1. P OLYMORPHISME DES LYSOSOMES
La cytologie électronique montre que les lysosomes constituent un ensemble polymorphe de
vésicules, aussi bien par leur taille, leur forme, que
Détection des activités phosphatasiques dans des cellules vivantes ou fixées
E NCARTT ECHNIQUE
Ces activités enzymatiques, nombreuses et très
diverses dans toutes les cellules, sont particulièrement intenses au niveau des membranes ou au
sein des lysosomes. Il s’agit d’estérases catalysant
l’hydrolyse de monoesters de l’acide phosphorique (H 2 PO 3 -R) en donnant de l’acide phosphorique (H 3 PO 4 ) et un alcool ou un phénol (R-OH).
La détection de cette activité en microscopie photonique est complexe car il faut obtenir en fin de
réaction un précipité opaque ou coloré. Le protocole est basé sur une série de plusieurs réactions
couplées. Le tissu vivant (ou des coupes obtenues après des fixations douces, ou bien par les
cryométhodes, qui préservent les activités enzymatiques) est incubé dans un mélange d’un
phosphate organique (le glycérophosphate ou
l’ATP, par exemple) et de nitrate de plomb. Le
H 3 PO 4 obtenu après hydrolyse est repris dans la
réaction spontanée suivante :
nitrate de plomb + H 3 PO 4 → phosphate
de plomb (insoluble)
Le précipité de phosphate de plomb s’accumule
donc à l’endroit où l’enzyme agit, mais il est invisible en lumière naturelle. On peut cependant le
transformer en un composé opaque en incubant
la préparation dans une solution de sulfure
d’ammonium qui, en réagissant avec le phosphate de plomb, conduit à la formation de sulfure de plomb noir, et donc visible. Ce type de
méthode permet de localiser des phosphatases
très variées car il suffit de changer la nature du
substrat initial et d’adapter les conditions d’incubation pour faire fonctionner spécifiquement telle
ou telle phosphatase. Pour la microscopie électronique, le protocole est plus simple car le précipité
de phosphate de plomb est opaque aux électrons
et d’emblée visible. Cette technique constitue le
prototype des réactions de cytoenzymologie.
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
3.1. Mise en évidence expérimentale
des lysosomes : un exemple atypique
De façon inhabituelle dans l’histoire de la biologie cellulaire, ces organites ont été mis en évidence
par des techniques utilisant le fractionnement cellulaire et les tests biochimiques, avant d’avoir été
décrits au plan cytologique. Leur découverte, vers
1950 (C. DE D UVE), s’est faite de la manière suivante. Lorsque l’activité spécifique de la phosphatase acide (voir 3.2.2.) est dosée dans des
homogénats de foie de rat, celle-ci est d’autant
plus élevée que ces derniers sont «maltraités », par
rapport aux précautions habituellement prises
dans les expériences d’enzymologie. Par exemple,
l’homogénéisation dans de l’eau distillée et non
pas dans un milieu osmotiquement équilibré,
l’emploi de détergents, une agitation mécanique
violente, développaient considérablement ( 10)
l’activité enzymatique. De même, des cycles successifs de congélation/décongélation des extraits,
ou des séjours prolongés à 4°C, connus pour altérer les protéines, avaient les mêmes conséquences.
En fait, tous les traitements censés détériorer les
organites avaient un effet stimulant sur cette
enzyme, supposée jusque-là hyaloplasmique. La
conclusion fut que cette activité était sans doute
localisée dans des vésicules encore non identifiées,
dont la destruction libérait le contenu et lui permettait de s’exprimer. Ce phénomène fut ensuite
démontré pour de nombreuses autres activités de
type hydrolases.
Les méthodes du fractionnement cellulaire,
associées à l’utilisation de gradients continus de
saccharose, très résolutifs, ont permis de séparer
– avec difficulté cependant – ces vésicules des mitochondries et des peroxysomes (voir chapitre 10).
Malgré leurs tailles assez différentes, ces trois types
d’organites sédimentent dans les mêmes conditions
de centrifugation différentielle. Le fait qu’ils possèdent des enzymes bien distinctes (enzymes marqueurs) a grandement facilité leur identification
sur les gradients. La nature des enzymes caractéristiques de ces nouveaux organites se prêtant bien
à la mise au point de tests cytoenzymologiques, y
compris en microscopie électronique (voir encart
suivant), ceux-ci furent rapidement visualisés au
sein de toutes les cellules eucaryotiques.
3.2. Ultrastructure et composition chimique
3.2.1. P OLYMORPHISME DES LYSOSOMES
La cytologie électronique montre que les lysosomes constituent un ensemble polymorphe de
vésicules, aussi bien par leur taille, leur forme, que
Détection des activités phosphatasiques dans des cellules vivantes ou fixées
E NCARTT ECHNIQUE
Ces activités enzymatiques, nombreuses et très
diverses dans toutes les cellules, sont particulièrement intenses au niveau des membranes ou au
sein des lysosomes. Il s’agit d’estérases catalysant
l’hydrolyse de monoesters de l’acide phosphorique (H 2 PO 3 -R) en donnant de l’acide phosphorique (H 3 PO 4 ) et un alcool ou un phénol (R-OH).
La détection de cette activité en microscopie photonique est complexe car il faut obtenir en fin de
réaction un précipité opaque ou coloré. Le protocole est basé sur une série de plusieurs réactions
couplées. Le tissu vivant (ou des coupes obtenues après des fixations douces, ou bien par les
cryométhodes, qui préservent les activités enzymatiques) est incubé dans un mélange d’un
phosphate organique (le glycérophosphate ou
l’ATP, par exemple) et de nitrate de plomb. Le
H 3 PO 4 obtenu après hydrolyse est repris dans la
réaction spontanée suivante :
nitrate de plomb + H 3 PO 4 → phosphate
de plomb (insoluble)
Le précipité de phosphate de plomb s’accumule
donc à l’endroit où l’enzyme agit, mais il est invisible en lumière naturelle. On peut cependant le
transformer en un composé opaque en incubant
la préparation dans une solution de sulfure
d’ammonium qui, en réagissant avec le phosphate de plomb, conduit à la formation de sulfure de plomb noir, et donc visible. Ce type de
méthode permet de localiser des phosphatases
très variées car il suffit de changer la nature du
substrat initial et d’adapter les conditions d’incubation pour faire fonctionner spécifiquement telle
ou telle phosphatase. Pour la microscopie électronique, le protocole est plus simple car le précipité
de phosphate de plomb est opaque aux électrons
et d’emblée visible. Cette technique constitue le
prototype des réactions de cytoenzymologie.