5. O RGANISATION GÉNÉRALE ET FONCTIONS DES MEMBRANES BIOLOGIQUES 123
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
Les détergents chargés électriquement (ou
ioniques, comme le SDS), sont très efficaces et
solubilisent les protéines les plus hydrophobes,
mais conduisent à leur dénaturation, souvent irréversiblement (c’est vrai pour toutes les protéines
en général, d’ailleurs). Il existe des détergents plus
doux (non ioniques), comme le Triton X-100, le
Tween ou le déoxycholate de Sodium, qui se fixent
seulement sur les domaines hydrophobes des protéines membranaires ; en formant un manchon
localisé autour d’elles, ils les solubilisent sans les
dénaturer.
Comme on le verra plus loin, de très nombreuses
protéines membranaires ont pour fonction de
transférer un composé d’un compartiment à un
autre, situés de part et d’autre de la membrane.
Cette fonction ne peut se concevoir en dehors
d’une structure et ne peut donc s’étudier en
«phase soluble » et de façon simple, comme c’est
le cas, par exemple pour les enzymes classiques.
2.5.2. A PPROCHE EXPÉRIMENTALE
DE LA TOPOGRAPHIE DES MEMBRANES
L’utilisation des détergents suivie de l’électrophorèse des protéines donne accès à la composition globale des membranes, mais pas à leur
architecture précise, c’est-à-dire la disposition de
ces molécules par rapport à la bicouche elle-même
et par rapport à l’intérieur ou l’extérieur de la cellule ou du compartiment analysés. Diverses
méthodes, directes ou indirectes, fournissent des
renseignements à ce sujet.
Une première technique consiste à marquer
radioactivement les protéines en place dans la
bicouche au moyen d’un système enzymatique : ce
système utilise une enzyme, la lactoperoxydase,
capable de fixer un atome d’iode radiomarqué
(
125
I) sur un résidu tyrosine accessible, en présence
d’H 2 O 2 . Mis en présence d’une cellule ou d’une
vésicule porteuse de protéines, ce système ne peut
marquer que les résidus Tyr appartenant aux
domaines externes des protéines car l’enzyme ne
peut pénétrer à l’intérieur des cellules ou des vésicules ; tout résidu Tyr situé dans la bicouche ou
appartenant à un domaine interne de la protéine
est donc inaccessible à l’enzyme. Après le marquage, on solubilise les protéines membranaires et
on les soumet à l’électrophorèse. Une autoradiographie permet ensuite de savoir quelles sont,
parmi elles, celles qui possèdent un domaine
externe (et possédant évidemment de la tyrosine à
ce niveau). Le découpage des protéines marquées
et purifiées par des protéases et l’étude des fragments obtenus complètent cette analyse en permettant de localiser exactement le ou les résidus le
long de la chaîne polypeptidique.
Certains modèles favorables comme les hématies de Mammifères autorisent une étude topographique plus poussée car il est, à partir de fantômes
de ces cellules traités par un protocole approprié,
possible d’obtenir des vésicules retournées (voir
figure 5.14). Le marquage de ces vésicules retournées par la lactoperoxydase, et l’analyse des protéines radioactives permettent donc d’identifier les
protéines transmembranaires (accessibles des deux
côtés de la membrane par le marquage) et celles
qui ont des domaines seulement tournés vers
l’intérieur de la cellule.
Na
+
/K
+
ATP dépendante, voir chapitre 6) ou,
inversement, des complexes générateurs d’ATP
(ATP synthétases, voir chapitre 10), nécessitant
des gradients de concentration de protons pour
leur activité.
protéine membranaire
bicouche
lipidique
complexe
protéine/détergent
hydrosoluble
micelle de
détergent
micelle mixte
lipide/détergent
hydrosoluble
Figure 5.13
Mode d’action des détergents sur les membranes
et les protéines membranaires
La solubilisation des protéines membranaires se fait sous
la forme de complexes protéine/détergent hydrosolubles. Les lipides membranaires se retrouvent sous la
forme de micelles mixtes.
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
Les détergents chargés électriquement (ou
ioniques, comme le SDS), sont très efficaces et
solubilisent les protéines les plus hydrophobes,
mais conduisent à leur dénaturation, souvent irréversiblement (c’est vrai pour toutes les protéines
en général, d’ailleurs). Il existe des détergents plus
doux (non ioniques), comme le Triton X-100, le
Tween ou le déoxycholate de Sodium, qui se fixent
seulement sur les domaines hydrophobes des protéines membranaires ; en formant un manchon
localisé autour d’elles, ils les solubilisent sans les
dénaturer.
Comme on le verra plus loin, de très nombreuses
protéines membranaires ont pour fonction de
transférer un composé d’un compartiment à un
autre, situés de part et d’autre de la membrane.
Cette fonction ne peut se concevoir en dehors
d’une structure et ne peut donc s’étudier en
«phase soluble » et de façon simple, comme c’est
le cas, par exemple pour les enzymes classiques.
2.5.2. A PPROCHE EXPÉRIMENTALE
DE LA TOPOGRAPHIE DES MEMBRANES
L’utilisation des détergents suivie de l’électrophorèse des protéines donne accès à la composition globale des membranes, mais pas à leur
architecture précise, c’est-à-dire la disposition de
ces molécules par rapport à la bicouche elle-même
et par rapport à l’intérieur ou l’extérieur de la cellule ou du compartiment analysés. Diverses
méthodes, directes ou indirectes, fournissent des
renseignements à ce sujet.
Une première technique consiste à marquer
radioactivement les protéines en place dans la
bicouche au moyen d’un système enzymatique : ce
système utilise une enzyme, la lactoperoxydase,
capable de fixer un atome d’iode radiomarqué
(
125
I) sur un résidu tyrosine accessible, en présence
d’H 2 O 2 . Mis en présence d’une cellule ou d’une
vésicule porteuse de protéines, ce système ne peut
marquer que les résidus Tyr appartenant aux
domaines externes des protéines car l’enzyme ne
peut pénétrer à l’intérieur des cellules ou des vésicules ; tout résidu Tyr situé dans la bicouche ou
appartenant à un domaine interne de la protéine
est donc inaccessible à l’enzyme. Après le marquage, on solubilise les protéines membranaires et
on les soumet à l’électrophorèse. Une autoradiographie permet ensuite de savoir quelles sont,
parmi elles, celles qui possèdent un domaine
externe (et possédant évidemment de la tyrosine à
ce niveau). Le découpage des protéines marquées
et purifiées par des protéases et l’étude des fragments obtenus complètent cette analyse en permettant de localiser exactement le ou les résidus le
long de la chaîne polypeptidique.
Certains modèles favorables comme les hématies de Mammifères autorisent une étude topographique plus poussée car il est, à partir de fantômes
de ces cellules traités par un protocole approprié,
possible d’obtenir des vésicules retournées (voir
figure 5.14). Le marquage de ces vésicules retournées par la lactoperoxydase, et l’analyse des protéines radioactives permettent donc d’identifier les
protéines transmembranaires (accessibles des deux
côtés de la membrane par le marquage) et celles
qui ont des domaines seulement tournés vers
l’intérieur de la cellule.
Na
+
/K
+
ATP dépendante, voir chapitre 6) ou,
inversement, des complexes générateurs d’ATP
(ATP synthétases, voir chapitre 10), nécessitant
des gradients de concentration de protons pour
leur activité.
protéine membranaire
bicouche
lipidique
complexe
protéine/détergent
hydrosoluble
micelle de
détergent
micelle mixte
lipide/détergent
hydrosoluble
Figure 5.13
Mode d’action des détergents sur les membranes
et les protéines membranaires
La solubilisation des protéines membranaires se fait sous
la forme de complexes protéine/détergent hydrosolubles. Les lipides membranaires se retrouvent sous la
forme de micelles mixtes.