5. O RGANISATION GÉNÉRALE ET FONCTIONS DES MEMBRANES BIOLOGIQUES 119
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
comme celles des mitochondries, qui présentaient
en coupe un aspect granuleux ; de plus, certaines
conséquences prévisibles de cette structure étaient
en contradiction avec les données physiologiques.
La présence d’un film continu de lipides semblait
par exemple incompatible avec la perméabilité à
l’eau et à certains composés polaires, comme on l’a
signalé au § 1.1. De nouvelles hypothèses ont donc
été proposées, tout au long des années 60, pour
adapter le modèle initial : l’existence de ponts
hydrophiles entre les deux faces de la membrane a
été évoquée, de même que celle d’unités répétitives construites à base de micelles ou d’agrégats
mixtes lipides/protéines.
Encore une fois, c’est la mise au point d’une
nouvelle technique, à la fin de cette décennie, qui a
permis d’avancer et de régler, de façon définitive
semble-t-il, la question de l’architecture membranaire ; il s’agit de la technique de cryofracture.
2.3. Apport de la technique de cryofracture:
la structure «en mosaïque »
Cette technique constitue un développement de
la technique dite d’ombrage métallique mise au
point dix ans plus tôt, et décrite dans le chapitre 3 ;
elle est d’abord basée sur la congélation très
rapide d’un tout petit échantillon biologique
(moins de 1 mm
3
), dans de l’azote liquide
(– 196 °C). Il s’agit donc d’une fixation physique
qui supprime tous les problèmes potentiels
d’artefacts, liés aux altérations ou interactions chimiques survenant au cours de la fixation chimique, de la déshydratation et de l’inclusion, dans
les méthodes classiques. La seule difficulté à surmonter est l’apparition de cristaux de glace ; la
congélation doit être très rapide (d’où la petitesse
de l’échantillon) et l’on est parfois amené à utiliser
des milieux «antigel », tels que le glycérol.
Les premières images fournies par cette technique ont complètement dérouté les observateurs
car l’aspect des membranes était inattendu,
compte tenu des modèles ayant cours à cette
époque. Les surfaces observées, supposées être
celles de la membrane plasmique (ou celles des
organites), apparaissaient en effet très granuleuses, présentant des «paquets » de grains de
tailles variées, répartis de manière plus ou moins
dense, sur un fond lisse et uniforme (voir
figure 5.10). Ce type de structure devant se rapprocher davantage, en théorie, de l’état natif des
membranes, il a fallu complètement revoir les
modèles d’architecture membranaire pour en tenir
compte.
L’utilisation de liposomes enrichis en protéines
membranaires purifiées ( protéoliposomes) a
confirmé que les granules observés étaient constitués de protéines, et que celles-ci étaient enchâssées
dans une bicouche phospholipidique continue,
elle-même en contact direct avec les phases
aqueuses situées de part et d’autre (le fond lisse vu
sur les répliques). Comme nous l’avons vu plus
haut, cette technique permet d’observer non seulement la surface des membranes, mais aussi d’étudier l’intérieur de celles-ci car la fracture passe
fréquemment entre les deux couches de phospholipides apposées, «arrachant » les protéines qui y
sont incluses ; elles se retrouvent donc sur une face
ou sur l’autre de la fracture.
Cryofracture et cryodécapage
L’étape cruciale du protocole est la fracture, et
non la coupure, de l’échantillon congelé, et ceci
à très basse température. Cette cryofracture
dégage une surface irrégulière à travers l’échantillon, et c’est cette surface qui sera observée. Il
a été montré que, de façon générale, le plan de
fracture passe à l’intérieur des membranes cellulaires, au sein même de la bicouche phospholipidique, car celle-ci représente une zone de
moindre résistance par rapport à la glace environnante (voir figure 5.9). On réalise ensuite le
décapage de la surface de l’échantillon en sublimant, sous vide et à basse température, une fine
pellicule de glace superficielle ; ce qui a pour
effet d’augmenter très légèrement les reliefs des
structures ( cryodécapage).
La suite des opérations consiste en un ombrage
métallique unilatéral, sous vide et à froid, pour
renforcer les reliefs (voir chapitre 3) ; un film de
carbone uniforme et très fin est ensuite vaporisé
par dessus la surface métallisée pour la renforcer
et couvrir les zones non atteintes par le métal.
On a ainsi réalisé un vrai moulage extrêmement
précis de la surface fracturée de l’échantillon : la
réplique ; c’est elle qui est observée au microscope électronique à transmission. Avant
l’observation, il aura fallu la décoller de l’échantillon par décongélation, bien la nettoyer par un
traitement sévère (eau de Javel, mélange sulfochromique), la rincer et enfin la déposer sur une
grille de microscopie électronique.
E NCARTT ECHNIQUE
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
comme celles des mitochondries, qui présentaient
en coupe un aspect granuleux ; de plus, certaines
conséquences prévisibles de cette structure étaient
en contradiction avec les données physiologiques.
La présence d’un film continu de lipides semblait
par exemple incompatible avec la perméabilité à
l’eau et à certains composés polaires, comme on l’a
signalé au § 1.1. De nouvelles hypothèses ont donc
été proposées, tout au long des années 60, pour
adapter le modèle initial : l’existence de ponts
hydrophiles entre les deux faces de la membrane a
été évoquée, de même que celle d’unités répétitives construites à base de micelles ou d’agrégats
mixtes lipides/protéines.
Encore une fois, c’est la mise au point d’une
nouvelle technique, à la fin de cette décennie, qui a
permis d’avancer et de régler, de façon définitive
semble-t-il, la question de l’architecture membranaire ; il s’agit de la technique de cryofracture.
2.3. Apport de la technique de cryofracture:
la structure «en mosaïque »
Cette technique constitue un développement de
la technique dite d’ombrage métallique mise au
point dix ans plus tôt, et décrite dans le chapitre 3 ;
elle est d’abord basée sur la congélation très
rapide d’un tout petit échantillon biologique
(moins de 1 mm
3
), dans de l’azote liquide
(– 196 °C). Il s’agit donc d’une fixation physique
qui supprime tous les problèmes potentiels
d’artefacts, liés aux altérations ou interactions chimiques survenant au cours de la fixation chimique, de la déshydratation et de l’inclusion, dans
les méthodes classiques. La seule difficulté à surmonter est l’apparition de cristaux de glace ; la
congélation doit être très rapide (d’où la petitesse
de l’échantillon) et l’on est parfois amené à utiliser
des milieux «antigel », tels que le glycérol.
Les premières images fournies par cette technique ont complètement dérouté les observateurs
car l’aspect des membranes était inattendu,
compte tenu des modèles ayant cours à cette
époque. Les surfaces observées, supposées être
celles de la membrane plasmique (ou celles des
organites), apparaissaient en effet très granuleuses, présentant des «paquets » de grains de
tailles variées, répartis de manière plus ou moins
dense, sur un fond lisse et uniforme (voir
figure 5.10). Ce type de structure devant se rapprocher davantage, en théorie, de l’état natif des
membranes, il a fallu complètement revoir les
modèles d’architecture membranaire pour en tenir
compte.
L’utilisation de liposomes enrichis en protéines
membranaires purifiées ( protéoliposomes) a
confirmé que les granules observés étaient constitués de protéines, et que celles-ci étaient enchâssées
dans une bicouche phospholipidique continue,
elle-même en contact direct avec les phases
aqueuses situées de part et d’autre (le fond lisse vu
sur les répliques). Comme nous l’avons vu plus
haut, cette technique permet d’observer non seulement la surface des membranes, mais aussi d’étudier l’intérieur de celles-ci car la fracture passe
fréquemment entre les deux couches de phospholipides apposées, «arrachant » les protéines qui y
sont incluses ; elles se retrouvent donc sur une face
ou sur l’autre de la fracture.
Cryofracture et cryodécapage
L’étape cruciale du protocole est la fracture, et
non la coupure, de l’échantillon congelé, et ceci
à très basse température. Cette cryofracture
dégage une surface irrégulière à travers l’échantillon, et c’est cette surface qui sera observée. Il
a été montré que, de façon générale, le plan de
fracture passe à l’intérieur des membranes cellulaires, au sein même de la bicouche phospholipidique, car celle-ci représente une zone de
moindre résistance par rapport à la glace environnante (voir figure 5.9). On réalise ensuite le
décapage de la surface de l’échantillon en sublimant, sous vide et à basse température, une fine
pellicule de glace superficielle ; ce qui a pour
effet d’augmenter très légèrement les reliefs des
structures ( cryodécapage).
La suite des opérations consiste en un ombrage
métallique unilatéral, sous vide et à froid, pour
renforcer les reliefs (voir chapitre 3) ; un film de
carbone uniforme et très fin est ensuite vaporisé
par dessus la surface métallisée pour la renforcer
et couvrir les zones non atteintes par le métal.
On a ainsi réalisé un vrai moulage extrêmement
précis de la surface fracturée de l’échantillon : la
réplique ; c’est elle qui est observée au microscope électronique à transmission. Avant
l’observation, il aura fallu la décoller de l’échantillon par décongélation, bien la nettoyer par un
traitement sévère (eau de Javel, mélange sulfochromique), la rincer et enfin la déposer sur une
grille de microscopie électronique.
E NCARTT ECHNIQUE