11 • Fluorimétrie et chimiluminescence
209
I 0
I F
filtre interne
préfiltre
c
a
b
Figure 11.4 Intensité de fluorescence.
Suivant l’endroit de la solution où la fluorescence est émise, une intensité lumineuse
variable atteint le détecteur ; il est possible d’évaluer la réabsorption de la lumière de
fluorescence (comparaison entre a et c) et l’absorption de la lumière incidente (comparaison entre a et b). La présence d’un iris fait que seule la lumière en provenance de la
partie centrale de la cuve, est recueillie.
En posant que I a = I 0 − I t (I t désignant l’intensité de la lumière transmise), la relation
11.2 permet de relier I f à la concentration c du composé :
I f = F f (I 0 − I t ) soit I f = F f · I 0 ·
1 −
I t
I 0
(11.3)
Sachant que l’absorbance A est égale à log I 0 /I , l’expression 11.3 devient :
I f = F f · I 0 ·(1 − 10
− A )
(11.4)
Or
10
− A = 1 − 2,303A +
(2,303A) 2
2!
− · · + · ·
Si la solution est diluée, le terme A est très petit et le terme 10
− A est donc proche de
1 − 2, 3A. L’expression (11.4) peut être simplifiée et devient :
I f = 2,3·F f · I 0 · A soit I f = 2,3·F f · I 0 · ´· ·c
(11.5)
avec I 0 l’intensité de la radiation excitatrice, c concentration molaire de la substance, ´ son
coefficient d’absorption molaire, épaisseur de la cuve, et F f rendement de fluorescence.
Cette dernière expression fait apparaître que l’intensité de fluorescence dépend de la
concentration (c), des conditions expérimentales (, I 0 ) et du composé (´, F f ). Dans la pratique d’un dosage, les paramètres propres au composé étudié et à l’appareil sont fixes. En les
réunissant dans un même facteur K , on écrira pour les très faibles concentrations ( A < 0,01)
I f = K · I 0 · c
(11.6)
Les dosages par fluorimétrie font appel aux nombreuses méthodes classiques d’étalonnage avec une seule ou plusieurs solutions de référence, ou encore aux méthodes d’ajout,
mais pour obtenir de bons résultats, les solutions doivent être très diluées.
Au-delà d’une certaine limite, la fluorescence n’est plus proportionnelle à la concentration par suite de la non linéarité de la loi de Beer. L’excitation est proportionnellement plus
faible et il apparaît des complexes d’association entre molécules excitées et molécules restées à l’état fondamental. On aboutit au résultat, qui semble paradoxal, selon lequel la fluorescence peut aller jusqu’à diminuer. La courbe de la figure 11.5 est l’illustration graphique
de l’expression 11.7 en donnant des valeurs raisonnables à ces différents paramètres.
I f = F·k · I 0 ·10
−(´ 1 1 +´ 2 2 )c
·(1 − 10
−´c )
(11.7)
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit
209
I 0
I F
filtre interne
préfiltre
c
a
b
Figure 11.4 Intensité de fluorescence.
Suivant l’endroit de la solution où la fluorescence est émise, une intensité lumineuse
variable atteint le détecteur ; il est possible d’évaluer la réabsorption de la lumière de
fluorescence (comparaison entre a et c) et l’absorption de la lumière incidente (comparaison entre a et b). La présence d’un iris fait que seule la lumière en provenance de la
partie centrale de la cuve, est recueillie.
En posant que I a = I 0 − I t (I t désignant l’intensité de la lumière transmise), la relation
11.2 permet de relier I f à la concentration c du composé :
I f = F f (I 0 − I t ) soit I f = F f · I 0 ·
1 −
I t
I 0
(11.3)
Sachant que l’absorbance A est égale à log I 0 /I , l’expression 11.3 devient :
I f = F f · I 0 ·(1 − 10
− A )
(11.4)
Or
10
− A = 1 − 2,303A +
(2,303A) 2
2!
− · · + · ·
Si la solution est diluée, le terme A est très petit et le terme 10
− A est donc proche de
1 − 2, 3A. L’expression (11.4) peut être simplifiée et devient :
I f = 2,3·F f · I 0 · A soit I f = 2,3·F f · I 0 · ´· ·c
(11.5)
avec I 0 l’intensité de la radiation excitatrice, c concentration molaire de la substance, ´ son
coefficient d’absorption molaire, épaisseur de la cuve, et F f rendement de fluorescence.
Cette dernière expression fait apparaître que l’intensité de fluorescence dépend de la
concentration (c), des conditions expérimentales (, I 0 ) et du composé (´, F f ). Dans la pratique d’un dosage, les paramètres propres au composé étudié et à l’appareil sont fixes. En les
réunissant dans un même facteur K , on écrira pour les très faibles concentrations ( A < 0,01)
I f = K · I 0 · c
(11.6)
Les dosages par fluorimétrie font appel aux nombreuses méthodes classiques d’étalonnage avec une seule ou plusieurs solutions de référence, ou encore aux méthodes d’ajout,
mais pour obtenir de bons résultats, les solutions doivent être très diluées.
Au-delà d’une certaine limite, la fluorescence n’est plus proportionnelle à la concentration par suite de la non linéarité de la loi de Beer. L’excitation est proportionnellement plus
faible et il apparaît des complexes d’association entre molécules excitées et molécules restées à l’état fondamental. On aboutit au résultat, qui semble paradoxal, selon lequel la fluorescence peut aller jusqu’à diminuer. La courbe de la figure 11.5 est l’illustration graphique
de l’expression 11.7 en donnant des valeurs raisonnables à ces différents paramètres.
I f = F·k · I 0 ·10
−(´ 1 1 +´ 2 2 )c
·(1 − 10
−´c )
(11.7)
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit