5 • Chromatographie planaire
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Figure 5.1 Appareil de dépôt automatique en CCM et de lecture de plaque.
Applicateur Linomat IV programmable, et densitomètre mesurant la lumière réfléchie
ou transmise par la plaque. Le schéma optique est assez semblable à celui d’un spectromètre UV/Visible (modèle Scanner 3, reproduit avec l’autorisation de la société Camag).
5.1.2 Développement de la plaque
La phase mobile migre par capillarité à travers la phase stationnaire sèche, entraînant à des
vitesses différentes les constituants à séparer. Le temps de migration (plusieurs minutes)
dépend de divers paramètres. Quand le front de solvant a parcouru une distance considérée
comme suffisante (quelques centimètres), on retire la plaque de la cuve, on repère la position
limite atteinte par la phase mobile et on évapore cette dernière.
Lorsqu’on utilise une plaque à polarité de phase inversée (« R P−TLC »), l’éluant comporte de l’eau. Il est alors utile d’ajouter un sel, tel du chlorure de lithium, pour limiter les
phénomènes de diffusion et augmenter ainsi la résolution.
5.1.3 Révélation post-chromatographique
La localisation des composés après migration se fait sur la plaque débarrassée de l’éluant.
Les composés qui donnent des taches invisibles doivent être « révélés » (fig. 5.2). À
cette fin la phase stationnaire contient un indicateur consistant en un sel de zinc qui émet
une fluorescence verte lorsqu’on éclaire la plaque au moyen d’une lampe U V à vapeur de
mercure (l = 254 nm). Tout composé qui absorbe à cette longueur d’onde apparaît sous
forme d’une tache sombre (ou quelquefois colorée) sur un fond illuminé en vert.
Une autre méthode quasi universelle de révélation consiste à carboniser les composés en
chauffant la plaque après l’avoir soumise à une pulvérisation d’acide sulfurique. Ce mode
d’examen n’est cependant pas utilisable en CCM quantitative : on effectue, dans ce cas, la
révélation par immersion dans des réactifs généraux (acide phosphomolybdique, vanilline),
ou spécifiques (ninhydrine en solution alcoolique pour les acides aminés, par exemple). Plusieurs centaines de réactifs répertoriés servent à introduire des groupements chromophores
ou fluorophores.
L’utilisation d’une plaque de forme carrée permet de faire de la chromatographie bidimensionnelle en procédant à deux élutions successives avec deux éluants différents (fig. 5.3).
Une application typique de cette méthode est la séparation des acides aminés. Pour n spots,
la résolution peut atteindre (n ∗ n) composés.
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit
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Figure 5.1 Appareil de dépôt automatique en CCM et de lecture de plaque.
Applicateur Linomat IV programmable, et densitomètre mesurant la lumière réfléchie
ou transmise par la plaque. Le schéma optique est assez semblable à celui d’un spectromètre UV/Visible (modèle Scanner 3, reproduit avec l’autorisation de la société Camag).
5.1.2 Développement de la plaque
La phase mobile migre par capillarité à travers la phase stationnaire sèche, entraînant à des
vitesses différentes les constituants à séparer. Le temps de migration (plusieurs minutes)
dépend de divers paramètres. Quand le front de solvant a parcouru une distance considérée
comme suffisante (quelques centimètres), on retire la plaque de la cuve, on repère la position
limite atteinte par la phase mobile et on évapore cette dernière.
Lorsqu’on utilise une plaque à polarité de phase inversée (« R P−TLC »), l’éluant comporte de l’eau. Il est alors utile d’ajouter un sel, tel du chlorure de lithium, pour limiter les
phénomènes de diffusion et augmenter ainsi la résolution.
5.1.3 Révélation post-chromatographique
La localisation des composés après migration se fait sur la plaque débarrassée de l’éluant.
Les composés qui donnent des taches invisibles doivent être « révélés » (fig. 5.2). À
cette fin la phase stationnaire contient un indicateur consistant en un sel de zinc qui émet
une fluorescence verte lorsqu’on éclaire la plaque au moyen d’une lampe U V à vapeur de
mercure (l = 254 nm). Tout composé qui absorbe à cette longueur d’onde apparaît sous
forme d’une tache sombre (ou quelquefois colorée) sur un fond illuminé en vert.
Une autre méthode quasi universelle de révélation consiste à carboniser les composés en
chauffant la plaque après l’avoir soumise à une pulvérisation d’acide sulfurique. Ce mode
d’examen n’est cependant pas utilisable en CCM quantitative : on effectue, dans ce cas, la
révélation par immersion dans des réactifs généraux (acide phosphomolybdique, vanilline),
ou spécifiques (ninhydrine en solution alcoolique pour les acides aminés, par exemple). Plusieurs centaines de réactifs répertoriés servent à introduire des groupements chromophores
ou fluorophores.
L’utilisation d’une plaque de forme carrée permet de faire de la chromatographie bidimensionnelle en procédant à deux élutions successives avec deux éluants différents (fig. 5.3).
Une application typique de cette méthode est la séparation des acides aminés. Pour n spots,
la résolution peut atteindre (n ∗ n) composés.
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit