Chapitre II
matériels et méthodes
33
Mode opératoire :
L’ensemble de l’appareillage stérile doit être placé prés d’un bec Bensun, de manière à
ménager une zone de travail stérile.
A l’aide d’une pince plate stérile, on dépose délicatement la membrane d’ester de
cellulose de 0,45µ m de porosité, sur le support du filtre.
Placer l’entonnoir sur le support et le fixer fermement.
Agiter soigneusement puis verser doucement dans chaque entonnoir un volume de
100 ml de l’échantillon ou de dilution (s).
Faire doucement le vide pour ne pas briser la membrane, jusqu’à la filtration totale de
l’échantillon ;
Retirer l’entonnoir et déposer la membrane filtrante à l’aide d’une pince stérile sur un
milieu spécifique pour les bactéries recherchées tout en évitant d’emprisonner des
bulles d’air marquées par la présence des taches blanches.
Inscrire sur la boite de pétri le numéro de l’échantillon, le germe recherché et la
dilution.
Placer les boites de Petri en position inverse et les incuber à une température donnée
et pendant une durée spécifique pour chaque germe.
2.4.2.1. Dénombrement de la flore totale
Des volumes de 100 ml d’échantillon et de dilutions (1/10, 1/100) ont été filtrés, les
membranes ont été déposées sur le milieu gélosé PCA (Plate Count Agar). Les boites sont
ensuite incubées à 37° C pendant 24h à 48h. On considère que chaque colonie dérive d’une
seule bactérie, Le résultat est exprimé en unité formant colonie (UFC)/100ml.
2.4.2.2. Dénombrement des coliformes totaux et coliformes fécaux
Après filtration des volumes de 100 ml des échantillons et des dilutions ( 1/10, 1/100) , les
membranes ont été déposées sur un milieu gélosé lactosé (gélose au tergitol). Les boites
destinées à la recherche des coliformes totaux ont été incubées à 37° C pendant 24h, alors que
celles destinées à la recherche des coliformes fécaux ont été incubées à 44° C pendant 24h
(figure n° 16). Les colonies fermentant le lactose (jaune avec un halo jaune) sont
dénombrées et le résultat est exprimé en UFC /100ml
2.4.2.3. Test confirmatif de la présence de l’Escherichia-Coli
La recherche d’E. coli a été effectuée par la mise en évidence de la production d’indole à
partir du tryptophane à 44° C.
Technique (figure n°16)
Ensemencer à partir de chaque colonie obtenue à 44° C, un tube d’eau peptonée
exempt d’indole (EPE).
Incuber à 44° C pendant 24h
Ajouter deux gouttes du réactif Kovacs aux tubes (EPE) présentant un trouble.
La présence d’E.coli se traduit par l’apparition d’un anneau rouge, indicateur de la
production d’indole à 44° C.
La confirmation de l’identification d’E. coli a été réalisée par galerie API 20E.
matériels et méthodes
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Mode opératoire :
L’ensemble de l’appareillage stérile doit être placé prés d’un bec Bensun, de manière à
ménager une zone de travail stérile.
A l’aide d’une pince plate stérile, on dépose délicatement la membrane d’ester de
cellulose de 0,45µ m de porosité, sur le support du filtre.
Placer l’entonnoir sur le support et le fixer fermement.
Agiter soigneusement puis verser doucement dans chaque entonnoir un volume de
100 ml de l’échantillon ou de dilution (s).
Faire doucement le vide pour ne pas briser la membrane, jusqu’à la filtration totale de
l’échantillon ;
Retirer l’entonnoir et déposer la membrane filtrante à l’aide d’une pince stérile sur un
milieu spécifique pour les bactéries recherchées tout en évitant d’emprisonner des
bulles d’air marquées par la présence des taches blanches.
Inscrire sur la boite de pétri le numéro de l’échantillon, le germe recherché et la
dilution.
Placer les boites de Petri en position inverse et les incuber à une température donnée
et pendant une durée spécifique pour chaque germe.
2.4.2.1. Dénombrement de la flore totale
Des volumes de 100 ml d’échantillon et de dilutions (1/10, 1/100) ont été filtrés, les
membranes ont été déposées sur le milieu gélosé PCA (Plate Count Agar). Les boites sont
ensuite incubées à 37° C pendant 24h à 48h. On considère que chaque colonie dérive d’une
seule bactérie, Le résultat est exprimé en unité formant colonie (UFC)/100ml.
2.4.2.2. Dénombrement des coliformes totaux et coliformes fécaux
Après filtration des volumes de 100 ml des échantillons et des dilutions ( 1/10, 1/100) , les
membranes ont été déposées sur un milieu gélosé lactosé (gélose au tergitol). Les boites
destinées à la recherche des coliformes totaux ont été incubées à 37° C pendant 24h, alors que
celles destinées à la recherche des coliformes fécaux ont été incubées à 44° C pendant 24h
(figure n° 16). Les colonies fermentant le lactose (jaune avec un halo jaune) sont
dénombrées et le résultat est exprimé en UFC /100ml
2.4.2.3. Test confirmatif de la présence de l’Escherichia-Coli
La recherche d’E. coli a été effectuée par la mise en évidence de la production d’indole à
partir du tryptophane à 44° C.
Technique (figure n°16)
Ensemencer à partir de chaque colonie obtenue à 44° C, un tube d’eau peptonée
exempt d’indole (EPE).
Incuber à 44° C pendant 24h
Ajouter deux gouttes du réactif Kovacs aux tubes (EPE) présentant un trouble.
La présence d’E.coli se traduit par l’apparition d’un anneau rouge, indicateur de la
production d’indole à 44° C.
La confirmation de l’identification d’E. coli a été réalisée par galerie API 20E.