Chapitre II
Matériels et méthodes
33
Technique
La réalisation de cette technique a été faite selon le protocole suivant :
- Mettre en place le dispositif de filtration en inox (Sartorius) dans la zone stérile, tout en
plaçant la membrane sur la plaque poreuse de la rampe.
- Verser dans chaque entonnoir un volume de 100ml d’échantillon bien homogénéisé.
- Faire le vide jusqu’à filtration totale de l’échontillon.
- Déposer la membrane à la surface d’une gélose de Mueller Hinton pour la flore totale et à la
surface d’une gélose au tergitol pour la recherche des coliformes totaux et thermotolérants.
La recherche de la flore totale et des coliformes totaux s’effectue à 37° C pendant 24-48h,
alors que les coliformes thermotolérants ont été recherchés à une température de 44° C
pendant 24-48h.
2.5.2.2. Dénombrement des Streptocoques fécaux par la méthode des NPP (nombre le
plus probable)
La méthode de dénombrement de ces germes est la méthode de fermentation en tubes
multiples qui est basée sur l’ensemencement d’une série de trois tubes contenant des milieux
liquides, puis sur la détermination du nombre le plus probable (NPP).
La détermination du nombre caractéristique (nombre de tubes positifs) permettra
l’établissement du nombre le plus probable par la consultation de la table de Mc Grady. Cette
méthode standard fait appel à deux tests consécutifs (RODIER et al, 2005) :
Le test présomptif : Réaliser sur le milieu Rothe, on utilisant trois séries de tubes de
Rothe :
- 1
ère
série : Trois tubes de 10ml de Rothe double concentré : ensemencé par 10ml d’eau
de mer.
- 2
ème
série : Trois tubes de 10ml de Rothe simple concentré : ensemencé par 1ml d’eau
de mer.
- 3
ème
série : Trois tubes de 10ml de Rothe simple concentré : ensemencé par 1ml d’eau
de la dilution 10
-1
.
Incuber à 37°c pendant 24heures.
Lecture : Un trouble dans le tube est considéré comme une réaction positive pour la
recherche des streptocoques fécaux.
Le test confirmatif : Consiste à réensemencé les tubes de Rothe positifs sur le milieu
d’Eva Litsky. Après on procède à l’incubation à 37° C pendant 24 heures. L’apparition
d’un trouble avec éventuellement une pastille blanchâtre ou violette est confirmative de la
présence des Streptocoques fécaux.
Noter le nombre positifs dans chaque série et le reporter dans la table de NPP pour obtenir le
nombre de streptocoques fécaux présents dans 100 ml de l’eau e mer (RODIER et al, 2005).
Matériels et méthodes
33
Technique
La réalisation de cette technique a été faite selon le protocole suivant :
- Mettre en place le dispositif de filtration en inox (Sartorius) dans la zone stérile, tout en
plaçant la membrane sur la plaque poreuse de la rampe.
- Verser dans chaque entonnoir un volume de 100ml d’échantillon bien homogénéisé.
- Faire le vide jusqu’à filtration totale de l’échontillon.
- Déposer la membrane à la surface d’une gélose de Mueller Hinton pour la flore totale et à la
surface d’une gélose au tergitol pour la recherche des coliformes totaux et thermotolérants.
La recherche de la flore totale et des coliformes totaux s’effectue à 37° C pendant 24-48h,
alors que les coliformes thermotolérants ont été recherchés à une température de 44° C
pendant 24-48h.
2.5.2.2. Dénombrement des Streptocoques fécaux par la méthode des NPP (nombre le
plus probable)
La méthode de dénombrement de ces germes est la méthode de fermentation en tubes
multiples qui est basée sur l’ensemencement d’une série de trois tubes contenant des milieux
liquides, puis sur la détermination du nombre le plus probable (NPP).
La détermination du nombre caractéristique (nombre de tubes positifs) permettra
l’établissement du nombre le plus probable par la consultation de la table de Mc Grady. Cette
méthode standard fait appel à deux tests consécutifs (RODIER et al, 2005) :
Le test présomptif : Réaliser sur le milieu Rothe, on utilisant trois séries de tubes de
Rothe :
- 1
ère
série : Trois tubes de 10ml de Rothe double concentré : ensemencé par 10ml d’eau
de mer.
- 2
ème
série : Trois tubes de 10ml de Rothe simple concentré : ensemencé par 1ml d’eau
de mer.
- 3
ème
série : Trois tubes de 10ml de Rothe simple concentré : ensemencé par 1ml d’eau
de la dilution 10
-1
.
Incuber à 37°c pendant 24heures.
Lecture : Un trouble dans le tube est considéré comme une réaction positive pour la
recherche des streptocoques fécaux.
Le test confirmatif : Consiste à réensemencé les tubes de Rothe positifs sur le milieu
d’Eva Litsky. Après on procède à l’incubation à 37° C pendant 24 heures. L’apparition
d’un trouble avec éventuellement une pastille blanchâtre ou violette est confirmative de la
présence des Streptocoques fécaux.
Noter le nombre positifs dans chaque série et le reporter dans la table de NPP pour obtenir le
nombre de streptocoques fécaux présents dans 100 ml de l’eau e mer (RODIER et al, 2005).