Chapitre II
MATÉRIELS ET MÉTHODES
41
Afin de lyser (détruire) les tissus et les cellules ; On rajoute du tampon à l'urée (Urée 8M,
Tris 2M, EDTA 0.5M, Na Cl 5M,) à raison de 10ml pour lg d'échantillon, qui permettent
la dissolution des lipides des membranes cellulaires et leur solubilisation.
Le mélange est transvasé dans des tubes coniques de 50ml puis ajouter 500μ1 de
protéinase K (20 mg/ml), cette enzyme hydrolyse les protéines (coupure des liaisons
peptidiques…).
Incuber dans l’étuve à 60°C pendant 2h.
Après incubation, on ajoute 10 ml de solution de phénol saturé à chaque tube et agiter
manuellement pendant 5 minutes, Mélanger par retournements successifs afin de faire
précipiter les protéines qui se ressemblent sous une forme insoluble, l’ADN reste en
solution dans la phase aqueuse qui est récupérée par centrifugation.
Le mélange est centrifugé à 2500 tr/mn pendant 10 mn (Équilibrer soigneusement les
tubes et centrifuger), la force centrifugeuse va séparer les constituants du mélange selon
leurs densités, les débris cellulaires s'accumulent au fond du tube en un culot, la solution
contenant l'ADN dissous forme le surnageant.
Récupérer le surnageant à l’aide d’une micropipette et le transférer dans un tube conique
propre de 50ml.
Ajouter au surnageant 2.5v de l'éthanol absolu et 1/10 de l’acétate de sodium (par rapport
au volume de l’échantillon) afin de précipiter les acides nucléiques.
On renverse lentement, on peut voir apparaitre un filament blanc ou un amas
correspondant à une méduse d'ADN.
Les échantillons sont ensuite centrifugés à 2500 tr/min pendant 5 min.
Jeter le liquide sans jeter la méduse et ajouter 7-10 ml (selon le volume de la méduse) de
la solution éthanol TE.
Conserver à 4°C.
Le diagramme qui résume les principales étapes de l’extraction de l’ADN représente dans la
figure(II.10) suivante :
MATÉRIELS ET MÉTHODES
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Afin de lyser (détruire) les tissus et les cellules ; On rajoute du tampon à l'urée (Urée 8M,
Tris 2M, EDTA 0.5M, Na Cl 5M,) à raison de 10ml pour lg d'échantillon, qui permettent
la dissolution des lipides des membranes cellulaires et leur solubilisation.
Le mélange est transvasé dans des tubes coniques de 50ml puis ajouter 500μ1 de
protéinase K (20 mg/ml), cette enzyme hydrolyse les protéines (coupure des liaisons
peptidiques…).
Incuber dans l’étuve à 60°C pendant 2h.
Après incubation, on ajoute 10 ml de solution de phénol saturé à chaque tube et agiter
manuellement pendant 5 minutes, Mélanger par retournements successifs afin de faire
précipiter les protéines qui se ressemblent sous une forme insoluble, l’ADN reste en
solution dans la phase aqueuse qui est récupérée par centrifugation.
Le mélange est centrifugé à 2500 tr/mn pendant 10 mn (Équilibrer soigneusement les
tubes et centrifuger), la force centrifugeuse va séparer les constituants du mélange selon
leurs densités, les débris cellulaires s'accumulent au fond du tube en un culot, la solution
contenant l'ADN dissous forme le surnageant.
Récupérer le surnageant à l’aide d’une micropipette et le transférer dans un tube conique
propre de 50ml.
Ajouter au surnageant 2.5v de l'éthanol absolu et 1/10 de l’acétate de sodium (par rapport
au volume de l’échantillon) afin de précipiter les acides nucléiques.
On renverse lentement, on peut voir apparaitre un filament blanc ou un amas
correspondant à une méduse d'ADN.
Les échantillons sont ensuite centrifugés à 2500 tr/min pendant 5 min.
Jeter le liquide sans jeter la méduse et ajouter 7-10 ml (selon le volume de la méduse) de
la solution éthanol TE.
Conserver à 4°C.
Le diagramme qui résume les principales étapes de l’extraction de l’ADN représente dans la
figure(II.10) suivante :