Annexe
 

 

 

 
• Ajouter 500 µl de SEWS-M préparé et remettre doucement le culot en suspension en
utilisant la force du liquide provenant de la pointe de la pipette ;
• Centrifuger à 14 000 x g pendant 1 minute. vider le tube de capture et le remplacer ;
• Sans aucun ajout de liquide, centrifuger une seconde fois à 14 000 x g pendant 2
minutes pour sécher la matrice de solution de lavage résiduelle. jeter le tube de capture
et le remplacer par un nouveau tube de capture propre ;
• Sécher à l'air le filtre d'essorage pendant 5 minutes à température ambiante ;
• Resuspendre doucement la matrice de liaison dans 50-100 µl de acqua gibco ;
centrifuger à 14 000 pendant 1 minute pour amener l'ADN élué dans le tube de capture
propre. jeter le filtre d'essorage.
Extraction d’ADN des échantillons d’eau de mer :
• Filtrer 100 ml d'eau de mer recueillie des différentes stations sur un filtre de 0,2 µm de
porosité (Millipore, Milan, Italie) ;
• Dans une boite de pétri, Ajouter 300 µl de solution de lyse (Tissue and cell lysis
solution, fournie avec le kit) plus 1 µl de Protéinase K au filtre. Laisser imbiber le
filtre puis bien le gratter ;
• Transférer le filtre ainsi que le liquide dans un tube eppendorf ;
• Incuber à 65°C pendant 15 minutes, puis centrifuger pour séparer le filtre du liquide ;
• Mettre les tubes dans de la glace pendant 3 à 5 minutes ;
• Ajouter 150 µl de MPC protein precipitation reagent (fourni dans le kit), et vortexer
vigoureusement pendant 10 secondes ;
• Centrifuger à 4°C pendant 10 minutes à 10 000 x g, et transférer le surnagent dans un
nouveau tube eppendorf ;
• Ajouter 500 µl d’isopropanol et mixer les tubes par retournement (30 à 40 fois)
• Conserver à -80°C pour favoriser la précipitation de l’ADN ;
• Centrifuger à 4°C pendant 10 minutes (14 000 x g) puis éliminer l’isopropanol en
faisant attention au précipité ;
• Ajouter 250 µl d’éthanol à 70%, centrifuger rapidement, éliminer le surnageant et
répéter l’opération une seconde fois, puis faire évaporer pendant 15 minutes ;
• Les acides nucléiques totaux ont été mis en suspension dans 50 µl de tampon TE
préchauffé à 45 ° C.