Annexe
 

 

 

 
Annexe 1:
Extraction d’ADN des échantillons de sédiment :
L’ADN total des échantillons de sédiments marins a été extrait à l’aide du kit pour sol
FastDNA ™ SPIN (MP Biomedicals, Santa Ana, Californie), selon les spécifications du
fournisseur
Procédure :
• Ajouter 500 mg d'échantillon de sédiment dans un tube à matrice de lyse (fourni dans
le kit) et ajouter 978 µl de tampon phosphate de sodium et 122 µl de MT Buffer. Les
protéines membranaires commencent à se solubiliser avec des détergents ainsi que des
protéines extracellulaires ;
• Homogénéiser dans le FastPrep instrument pendant 40 secondes à une vitesse 6.0 ;
• Centrifuger à 14 000 x g pendant 5 à 10 minutes. Ceci va causer une perturbation
mécanique des parois cellulaires des microorganismes du sédiment et libération
d'acides nucléiques dans le tampon protecteur ;
• Transférer le surnageant dans des tubes de 2 ml, ajouter 250 µl de PPS (Protein
Precipitation Solution) et mixer en inversant les tubes 10 fois afin séparer les acides
nucléiques solubilisés des débris cellulaires et de la matrice de lyse ;
• Centrifuger à 14 000 x g pendant 5 minutes et transférer le surnageant dans des tubes
propres de 15 ml ; un tube de 2 ml aurait suffit, mais un tube plus large est plus
pratique pour un meilleur mélange ;
• Remettre en suspension la matrice et ajouter 1 ml de surnageant dans le tube de 15
ml ;
• Placer sur le rotateur ou inverser à la main pendant 2 minutes pour permettre la liaison
de l'ADN ;
• Placer le tube dans un portoir pendant 3 minutes pour permettre la sédimentation de la
matrice de silice (les acides nucléiques se lient à la matrice de silice en présence de
sels chaotropes) ;
• Retirer et jeter 500 µl de surnageant en prenant soin d'éviter la matrice de liaison
décollée ;
• Remettre doucement en suspension la matrice de liaison dans la quantité restante de
surnageant. transférer environ 600 µl du mélange sur un filtre Spin et centrifuger à 14
000 x g pendant 1 minute. vider le tube collecteur et ajouter le mélange restant dans le
filtre Spin et centrifuger comme avant. vider le tube de capture à nouveau ;