Chapitre II :
Matériel et méthodes.
25
II.5.7.2 Recherche sur MacConkey
A partir de nos échantillons, nous avons procédé à l’ensemencement par inondation (1 ml)
à l’aide d’une micropipette sur des boites de pétri qui contiennent le milieu MacConkey ;
puis nous avons réalisé un ré-isolement de quelques colonies. L’incubation se fait à 37°C
pendant 24-48 h.
L’identification des bactéries récupérées sur les deux milieux sera confirmée par une
coloration de Gram et des tests biochimiques d’oxydase et de catalase et un
ensemencement d’une galerie API 20 E
II.6 Test d’identification
II.6.1 Coloration de Gram
 Principe : C’est la coloration de base en bactériologie qui permet de distinguer les
bactéries selon leur paroi en bactéries à Gram positif et bactéries à Gram négatif,
cette distinction est fondamentale pour leur identification.
En effet, le violet de gentiane colore le cytoplasme et après ce temps de coloration, toutes
les bactéries sont violettes. Chez les bactéries à Gram négatif, la paroi, riche en lipides,
laisse passer l'alcool (ou le mélange alcool + acétone) qui décolore le cytoplasme alors que,
chez les bactéries à Gram positif, la paroi par sa composition (peptidoglycane épais et
présence d’acides teichoiques), constitue une barrière imperméable à l'alcool et le
cytoplasme demeure coloré en violet.
 Réactifs :
Violet de gentiane phénique - Lugol (iodo-iodure de potassium) - Alcool à 95% (ou
mélange alcool absolu+ 1/5ème d’acétone) - Safranine (ou Fushine phéniquée de ziehl).
 Mode opératoire :
1. Réaliser un frottis et le fixer à la flamme.
2. Verser le Violet de Gentiane sur la lame ; laisser en contact 1 minute.
3. Fixer le colorant par le Lugol environ 1min.
4. Jeter le Lugol et faire couler de l’alcool sur la préparation, laisser agir 30sec et rincer
immédiatement à l’eau.
5. Recouvrir la préparation de fushine, laisser agir environ 1 min. laver abondamment.
6. Sécher au-dessus de la flamme d’un bec Bunsen.