Chapitre II :
Matériel et méthodes.
21
Test biochimique : Oxydase et catalase (voir le titre II.6).
II.5.4 Recherche des Entérocoques
Principe (Rodier, 1996) : Conformément à la norme NF T 90-411, le principe se
résume à la recherche des entérocoques et Streptocoques du groupe D en milieu
liquide. Alors que les tubes primaires contiennent déjà une certaine quantité d'azide
de sodium (milieu de Rothe), le repiquage des tubes positifs se fait sur un milieu
nettement inhibiteur avec une concentration plus élevée en azide de sodium et de
cristaux violets (milieu Litsky), ne laissant se développer que les Streptocoques ou
Entérocoques ; on utilise aussi le milieu BEA qui est un milieu sélectif pour les
entérocoques comme un test de confirmation et un milieu d’isolement.
Test présomptif : 1ml d’échantillon a été ensemencé dans le milieu Rothe.
L'ensemble des tubes ainsi préparés sont incubés à 37° C pendant 24 à 48 h. Les
tubes présentant un trouble bactérien sont considérés comme présomptifs de la
présence des entérocoques.
Test confirmatif : Nous prélevons 2 à 3 gouttes de chaque tube positif présentant
un trouble bactérien, que nous repiquons dans des tubes contenant 9 ml de milieu
Litsky. Par la suite les tubes sont incubés à 37° C pendant 24h.
Lecture : Nous considérons comme positifs les tubes dans lesquels il y a apparition
d'un trouble bactérien qui confirme la présence des entérocoques ; parfois, la
culture s'agglomère au fond du tube en fixant le colorant et en formant une pastille
violette de signification identique à celle du trouble bactérien.
BEA (Bile Esculine Azide) : Un ré isolement à partir de Litsky a été effectué sur
milieu BEA à 37 °C pendant 24 heures. Des colonies noires montrent l'hydrolyse
de l'esculine qui est révélée par les ions de fer.
Des tests de confirmation des entérocoques ont été réalisés selon le centre d’expertise en
analyse environnementale du Québec (2014).
Coloration de Gram (voir le titre II.6).
Test de la catalase (voir le titre II.6): Une réaction négative à l’épreuve de la
catalase indique la présence possible d’entérocoques.
Épreuve de croissance en bouillon infusion cœur-cervelle à 45 °C : À partir du
bouillon infusion cœur-cervelle de 24 h, prélever un inoculum de manière aseptique
à l’aide d’un fil à boucle. Inoculer 5 ml d’un bouillon infusion cœur-cervelle.
Matériel et méthodes.
21
Test biochimique : Oxydase et catalase (voir le titre II.6).
II.5.4 Recherche des Entérocoques
Principe (Rodier, 1996) : Conformément à la norme NF T 90-411, le principe se
résume à la recherche des entérocoques et Streptocoques du groupe D en milieu
liquide. Alors que les tubes primaires contiennent déjà une certaine quantité d'azide
de sodium (milieu de Rothe), le repiquage des tubes positifs se fait sur un milieu
nettement inhibiteur avec une concentration plus élevée en azide de sodium et de
cristaux violets (milieu Litsky), ne laissant se développer que les Streptocoques ou
Entérocoques ; on utilise aussi le milieu BEA qui est un milieu sélectif pour les
entérocoques comme un test de confirmation et un milieu d’isolement.
Test présomptif : 1ml d’échantillon a été ensemencé dans le milieu Rothe.
L'ensemble des tubes ainsi préparés sont incubés à 37° C pendant 24 à 48 h. Les
tubes présentant un trouble bactérien sont considérés comme présomptifs de la
présence des entérocoques.
Test confirmatif : Nous prélevons 2 à 3 gouttes de chaque tube positif présentant
un trouble bactérien, que nous repiquons dans des tubes contenant 9 ml de milieu
Litsky. Par la suite les tubes sont incubés à 37° C pendant 24h.
Lecture : Nous considérons comme positifs les tubes dans lesquels il y a apparition
d'un trouble bactérien qui confirme la présence des entérocoques ; parfois, la
culture s'agglomère au fond du tube en fixant le colorant et en formant une pastille
violette de signification identique à celle du trouble bactérien.
BEA (Bile Esculine Azide) : Un ré isolement à partir de Litsky a été effectué sur
milieu BEA à 37 °C pendant 24 heures. Des colonies noires montrent l'hydrolyse
de l'esculine qui est révélée par les ions de fer.
Des tests de confirmation des entérocoques ont été réalisés selon le centre d’expertise en
analyse environnementale du Québec (2014).
Coloration de Gram (voir le titre II.6).
Test de la catalase (voir le titre II.6): Une réaction négative à l’épreuve de la
catalase indique la présence possible d’entérocoques.
Épreuve de croissance en bouillon infusion cœur-cervelle à 45 °C : À partir du
bouillon infusion cœur-cervelle de 24 h, prélever un inoculum de manière aseptique
à l’aide d’un fil à boucle. Inoculer 5 ml d’un bouillon infusion cœur-cervelle.