MATERIEL ET METHODES
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II.2.2 Identification
II.2.2.1 Caractères morphologiques
II.2.2.1.1 Aspect macroscopique
Le premier critère d’identification est celui de l’aspect macroscopique des colonies isolées
vues à l’œil nu; taille, forme du relief (bombée, semi bombée, plate), couleur, aspect (collant,
filamenteux...), odeur, transparence (opaque, translucide), allure des contours (régulier,
dentelés), pigmentation, et aspect de la surface (lisse ou rugueuse).
II.2.2.1.2 Aspect microscopique (coloration de gram)
Cette technique a pour but de déterminer l’aspect microscopique de la bactérie (morphologie :
cocci, bacille.. et agencement) ainsi que la nature de sa paroi (Gram+, Gram-).
Préparation d’un frottis
À l’aide d’une anse de platine, une colonie bactérienne jeune a été prélevée et déposée sur
une lame propre contenant une goutte d’eau stérile. Elle a ensuite été étalée, séchée puis fixée
à la chaleur du bec bunsen.
Coloration de Gram
Quelques gouttes de violet de Gentiane ont été déposées sur le frottis fixé pendant une
minute, après rinçage, on ajoute le Lugol pendant 30 secondes.
Le violet de gentiane va permettre de colorer le cytoplasme des bactéries, quant au
Lugol (composé iodé) joue le rôle d’un mordant qui permet de fixer le violet dans les
bactéries.
La décoloration se fait en coulant la solution d’alcool sur la lame jusqu'à ce que le
violet ne s’écoule plus du frottis, entre 5 à 10 secondes. L’alcool ne va traverser que la
paroi de certaines bactéries (Gram-) et décolorer leur cytoplasme.
La dernière étape consiste à verser quelques gouttes de Fushine sur la lame en laissant
agir une minute. Le colorant permet de visualiser les bactéries décolorées (Gram
négatif).
Après chaque étape, la lame est rincée avec de l’eau distillée.
Après séchage, on passe à l’observation microscopique (grossissement 40X puis
100X) où les cellules Gram positif apparaissent en violet et les cellules Gram négatif
apparaissent en rose (BARTHOLOMEW et MITTWER , 1952).
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II.2.2 Identification
II.2.2.1 Caractères morphologiques
II.2.2.1.1 Aspect macroscopique
Le premier critère d’identification est celui de l’aspect macroscopique des colonies isolées
vues à l’œil nu; taille, forme du relief (bombée, semi bombée, plate), couleur, aspect (collant,
filamenteux...), odeur, transparence (opaque, translucide), allure des contours (régulier,
dentelés), pigmentation, et aspect de la surface (lisse ou rugueuse).
II.2.2.1.2 Aspect microscopique (coloration de gram)
Cette technique a pour but de déterminer l’aspect microscopique de la bactérie (morphologie :
cocci, bacille.. et agencement) ainsi que la nature de sa paroi (Gram+, Gram-).
Préparation d’un frottis
À l’aide d’une anse de platine, une colonie bactérienne jeune a été prélevée et déposée sur
une lame propre contenant une goutte d’eau stérile. Elle a ensuite été étalée, séchée puis fixée
à la chaleur du bec bunsen.
Coloration de Gram
Quelques gouttes de violet de Gentiane ont été déposées sur le frottis fixé pendant une
minute, après rinçage, on ajoute le Lugol pendant 30 secondes.
Le violet de gentiane va permettre de colorer le cytoplasme des bactéries, quant au
Lugol (composé iodé) joue le rôle d’un mordant qui permet de fixer le violet dans les
bactéries.
La décoloration se fait en coulant la solution d’alcool sur la lame jusqu'à ce que le
violet ne s’écoule plus du frottis, entre 5 à 10 secondes. L’alcool ne va traverser que la
paroi de certaines bactéries (Gram-) et décolorer leur cytoplasme.
La dernière étape consiste à verser quelques gouttes de Fushine sur la lame en laissant
agir une minute. Le colorant permet de visualiser les bactéries décolorées (Gram
négatif).
Après chaque étape, la lame est rincée avec de l’eau distillée.
Après séchage, on passe à l’observation microscopique (grossissement 40X puis
100X) où les cellules Gram positif apparaissent en violet et les cellules Gram négatif
apparaissent en rose (BARTHOLOMEW et MITTWER , 1952).