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Pour cette dernière catégorie, il existe présentement quatre technologies principales :
hydrolyse de sondes (Taqman assay), hybridation de 2 sondes (HybProbes), balises
moléculaires (Molecular Beacons) et amorces scorpion (Scorpion primers) (Poitras et
Houde, 2002).
1) Agents se liant à l’ADN double brin (Double-stranded DNA binding dyes:
Lightcycler assay)
Les molécules qui se lient à l’ADN double brin peuvent être divisées en deux classes: les
agents intercalants comme le bromure d’éthidium (Higuchi et al, 1992), le YO-PRO-1
(Ishiguro et al, 1995; Tseng et al, 1997), le SYBR Green I (Morrison et al, 1998) et les agents
se fixant au sillon mineur (minor groove binders) comme le Hoeschst 33258 (Searle et
Embrey, 1990; Nielsen, 1991). Leur émission fluorescente augmente lorsque qu’ils sont liés
à l’ADN double brin. Pour être utilisés dans une réaction de PCR en temps réel, ces agents
doivent rencontrer deux exigences : augmenter en fluorescence lorsque lié à l’ADN double
brin et ne pas inhiber la réaction de PCR (Poitras et Houde, 2002).
2) Les sondes fluorescentes
-Hydrolyse de sondes (Hydrolysis probes: Taqman assay)
Les sondes fluorescentes possèdent comme avantage par rapport aux agents se liant à l’ADN
une spécificité accrue et une meilleure capacité de multiplexage. La spécificité d’hybridation
entre la sonde fluorescente et sa séquence d’ADN cible réduit significativement l’émission de
fluorescence non spécifique due à des mauvais appariements ou des dimères d’amorces
(primer-dimers) (Poitras et Houde, 2002).
-Hybridation de 2 sondes (Hybridization probes)
Cette technologie est aussi connue sous le nom de HybProbes et repose sur l’utilisation de
deux sondes linéaires complémentaires à une séquence cible pour maximiser la spécificité du
signal (Wittwer et al, 1997). Cette technologie possède donc une grande spécificité et permet
aussi une grande flexibilité dans le design des sondes. De plus, comme les sondes ne sont pas
hydrolysées, elles sont réutilisées à chacun des cycles (Bustin, 2000) (Poitras et Houde,
2002).
-Balises moléculaires (sonde d’hybridation en épingle à cheveux: Molecular Beacons)
Une balise moléculaire est une sonde d’hybridation d’ADN en forme d’épingle à cheveux
Pour cette dernière catégorie, il existe présentement quatre technologies principales :
hydrolyse de sondes (Taqman assay), hybridation de 2 sondes (HybProbes), balises
moléculaires (Molecular Beacons) et amorces scorpion (Scorpion primers) (Poitras et
Houde, 2002).
1) Agents se liant à l’ADN double brin (Double-stranded DNA binding dyes:
Lightcycler assay)
Les molécules qui se lient à l’ADN double brin peuvent être divisées en deux classes: les
agents intercalants comme le bromure d’éthidium (Higuchi et al, 1992), le YO-PRO-1
(Ishiguro et al, 1995; Tseng et al, 1997), le SYBR Green I (Morrison et al, 1998) et les agents
se fixant au sillon mineur (minor groove binders) comme le Hoeschst 33258 (Searle et
Embrey, 1990; Nielsen, 1991). Leur émission fluorescente augmente lorsque qu’ils sont liés
à l’ADN double brin. Pour être utilisés dans une réaction de PCR en temps réel, ces agents
doivent rencontrer deux exigences : augmenter en fluorescence lorsque lié à l’ADN double
brin et ne pas inhiber la réaction de PCR (Poitras et Houde, 2002).
2) Les sondes fluorescentes
-Hydrolyse de sondes (Hydrolysis probes: Taqman assay)
Les sondes fluorescentes possèdent comme avantage par rapport aux agents se liant à l’ADN
une spécificité accrue et une meilleure capacité de multiplexage. La spécificité d’hybridation
entre la sonde fluorescente et sa séquence d’ADN cible réduit significativement l’émission de
fluorescence non spécifique due à des mauvais appariements ou des dimères d’amorces
(primer-dimers) (Poitras et Houde, 2002).
-Hybridation de 2 sondes (Hybridization probes)
Cette technologie est aussi connue sous le nom de HybProbes et repose sur l’utilisation de
deux sondes linéaires complémentaires à une séquence cible pour maximiser la spécificité du
signal (Wittwer et al, 1997). Cette technologie possède donc une grande spécificité et permet
aussi une grande flexibilité dans le design des sondes. De plus, comme les sondes ne sont pas
hydrolysées, elles sont réutilisées à chacun des cycles (Bustin, 2000) (Poitras et Houde,
2002).
-Balises moléculaires (sonde d’hybridation en épingle à cheveux: Molecular Beacons)
Une balise moléculaire est une sonde d’hybridation d’ADN en forme d’épingle à cheveux