Ganglions sentinelles 139
en présence d’une sous-expression de la CK19, il ne permet pas d’affirmer
l’absence de métastase. Cette question a eu le mérite de conduire à des investigations pour mieux connaître le taux de sous-expression de la CK19 dans les
tumeurs mammaires. Ces investigations ont pu mettre en évidence l’absence
d’expression de la CK19 dans moins de 2,5 % des tumeurs mammaires [28].
Actuellement l’Association francophone pour l’étude en biologie moléculaire
du ganglion sentinelle préconise d’analyser tout le tissu avec OSNA et de
réaliser une apposition du ganglion, afin de garder une empreinte cytologique.
Les GS entre 50 et 600 mg sont lysés dans 4 mL de lynorhag, les ganglions de
plus de 600 mg sont partagés et analysés en plusieurs fractions. Pour les petits
ganglions < 50 mg, le fournisseur n’a pas validé la procédure. La particularité
de ce test est l’absence d’extraction d’acides nucléiques, l’amplification moléculaire étant directement réalisée sur le lysat. Deux préparations du lysat sont
amplifiées : le lysat pur et une dilution de celui-ci au 1/10 e . Cette dilution a été
ajoutée à la procédure car certaines métastases n’avaient pas été détectées avec
le test OSNA, du fait de substances interférentes dans le lysat qui bloquaient
la réaction d’amplification. La dilution du lysat et donc des substances potentiellement inhibitrices de la réaction d’amplification a pour but de lever cette
inhibition, ainsi ces métastases sont mieux détectées.
L’amplification par RT LAMP est automatisée sur un instrument appelé
RD100i, dont la calibration doit être réalisée pour chaque journée opératoire ou lors de l’ouverture et de l’installation de tout nouveau réactif sur la
machine. Pour ce faire, un set de trois calibrateurs est utilisé, puis la calibration
est validée par deux contrôles, un positif et un négatif. Une fois calibrée, la
machine est prête pour l’analyse des échantillons avec au maximum 4 échantillons pouvant être analysés simultanément en une série. Le temps d’amplification est de 16 minutes, auquel il faut ajouter le temps de distribution des
réactifs et des échantillons. La machine ne dispose que d’un bras de distribution, donc le temps d’analyse s’allonge avec le nombre d’échantillons. Tout le
matériel en place sur la machine est à usage unique : pointe de distribution,
cupules de réaction. Pour chaque série d’amplification, un contrôle négatif et
un contrôle positif sont systématiquement ajoutés pour valider la série.
La technique RT LAMP [29] est une procédure isothermique utilisant
6 amorces qui garantissent une amplification hautement spécifique et sensible
(fig. 4).
Chaque fois qu’un nucléotide est utilisé pour l’amplification, il libère du pyrophosphate dans le milieu réactionnel qui contient du magnésium. Le principe de détection de la réaction d’amplification repose sur la formation d’un
complexe de pyrophosphate de magnésium qui trouble le milieu réactionnel.
Le seuil de turbidité pour la détection de ce trouble est fixé à 0,1. Le temps de
réaction nécessaire pour atteindre ce seuil (temps d’élévation pour rise time) est
e
inversement proportionnel aux nombres de copies d’ARNm CK19 présentes
dans l’échantillon initial. Les seuils de détection de la technique OSNA ont
été fixés en analysant des ganglions normaux et des ganglions présentant un
en présence d’une sous-expression de la CK19, il ne permet pas d’affirmer
l’absence de métastase. Cette question a eu le mérite de conduire à des investigations pour mieux connaître le taux de sous-expression de la CK19 dans les
tumeurs mammaires. Ces investigations ont pu mettre en évidence l’absence
d’expression de la CK19 dans moins de 2,5 % des tumeurs mammaires [28].
Actuellement l’Association francophone pour l’étude en biologie moléculaire
du ganglion sentinelle préconise d’analyser tout le tissu avec OSNA et de
réaliser une apposition du ganglion, afin de garder une empreinte cytologique.
Les GS entre 50 et 600 mg sont lysés dans 4 mL de lynorhag, les ganglions de
plus de 600 mg sont partagés et analysés en plusieurs fractions. Pour les petits
ganglions < 50 mg, le fournisseur n’a pas validé la procédure. La particularité
de ce test est l’absence d’extraction d’acides nucléiques, l’amplification moléculaire étant directement réalisée sur le lysat. Deux préparations du lysat sont
amplifiées : le lysat pur et une dilution de celui-ci au 1/10 e . Cette dilution a été
ajoutée à la procédure car certaines métastases n’avaient pas été détectées avec
le test OSNA, du fait de substances interférentes dans le lysat qui bloquaient
la réaction d’amplification. La dilution du lysat et donc des substances potentiellement inhibitrices de la réaction d’amplification a pour but de lever cette
inhibition, ainsi ces métastases sont mieux détectées.
L’amplification par RT LAMP est automatisée sur un instrument appelé
RD100i, dont la calibration doit être réalisée pour chaque journée opératoire ou lors de l’ouverture et de l’installation de tout nouveau réactif sur la
machine. Pour ce faire, un set de trois calibrateurs est utilisé, puis la calibration
est validée par deux contrôles, un positif et un négatif. Une fois calibrée, la
machine est prête pour l’analyse des échantillons avec au maximum 4 échantillons pouvant être analysés simultanément en une série. Le temps d’amplification est de 16 minutes, auquel il faut ajouter le temps de distribution des
réactifs et des échantillons. La machine ne dispose que d’un bras de distribution, donc le temps d’analyse s’allonge avec le nombre d’échantillons. Tout le
matériel en place sur la machine est à usage unique : pointe de distribution,
cupules de réaction. Pour chaque série d’amplification, un contrôle négatif et
un contrôle positif sont systématiquement ajoutés pour valider la série.
La technique RT LAMP [29] est une procédure isothermique utilisant
6 amorces qui garantissent une amplification hautement spécifique et sensible
(fig. 4).
Chaque fois qu’un nucléotide est utilisé pour l’amplification, il libère du pyrophosphate dans le milieu réactionnel qui contient du magnésium. Le principe de détection de la réaction d’amplification repose sur la formation d’un
complexe de pyrophosphate de magnésium qui trouble le milieu réactionnel.
Le seuil de turbidité pour la détection de ce trouble est fixé à 0,1. Le temps de
réaction nécessaire pour atteindre ce seuil (temps d’élévation pour rise time) est
e
inversement proportionnel aux nombres de copies d’ARNm CK19 présentes
dans l’échantillon initial. Les seuils de détection de la technique OSNA ont
été fixés en analysant des ganglions normaux et des ganglions présentant un