De façon similaire aux acides aminés, les propriétés physiques d’un peptide ou
d’une protéine changent radicalement lorsque le pH de la solution aqueuse devient
égal au point isoélectrique. La forme zwitterionique (de charge nulle) est alors majoritairement prépondérante et la solubilité dans l’eau est minimale. Cette propriété est
d’ailleurs mise à pro?t pour la précipitation sélective (en ajustant le pH) d’une protéine
particulière à partir d’un mélange donné.
Exemple 6.5
Décrivez l’isolation de la caséine à partir d’une solution aqueuse contenant
également de la trypsine et du lysozyme.
Solution
La caséine, la trypsine et le lysozyme ont des pI respectifs de 4,6, 10,8 et 11,0. L’ajustement
du pH de la solution à 4,6 provoque la précipitation de la caséine, alors que les deux autres
protéines y sont encore solubles. La caséine peut donc être isolée par une simple ?ltration.
6.7.2 Détermination de la composition en acides aminés
Après avoir déterminé la masse molaire et le pI d’un peptide ou d’une protéine, l’étape
suivante consiste à déterminer la composition en acides aminés, c’est-à-dire l’identi?cation de tous les acides aminés constituant le peptide ou la protéine, ainsi que leur
nombre. L’hydrolyse d’un peptide ou d’une protéine permet de briser la majorité des
liens peptidiques et d’obtenir un mélange de tous les acides aminés le constituant.
Avant d’effectuer cette hydrolyse, il faut toutefois tenir compte du fait que les peptides et les protéines sont présents dans la nature sous forme d’assemblages qu’il faut
briser pour avoir accès aux chaînes ou aux cycles individuels. Un traitement avec
une solution d’urée ou de chlorure de guanidinium clive les liaisons non covalentes
(principalement les ponts hydrogène) entre les chaînes ou les cycles, et permet d’accéder à des versions monomoléculaires de ces derniers. Dans un deuxième temps, il
faut s’assurer de réduire les ponts disulfure par un traitement au 2-mercaptoéthanol
(HSCH 2 CH 2 OH), lequel sera suivi d’un traitement à l’acide iodoéthanoïque a?n de
bloquer les extrémités thiols libres (voir la ?gure 6.25).
Figure 6.25 Réduction et inactivation des ponts disulfure d’un peptide ou d’une protéine
Après ces traitements préliminaires, l’hydrolyse du peptide ou de la protéine est
effectuée à l’aide de HCl 6 mol/L à reux pendant 24 à 48 heures. Le mélange d’acides
aminés est ensuite séparé par chromatographie. Les techniques chromatographiques
de séparation des acides aminés sont aujourd’hui automatisées, ce qui simpli?e grandement le processus. L’échantillon du mélange à puri?er est déposé sur une colonne
contenant une résine échangeuse d’ions (c’est-à-dire un polymère insoluble contenant
des groupements fonctionnels fortement acides tels les acides sulfoniques, ROSO 3 H).
Les groupements acides de la résine protonent les acides aminés, causant ainsi des interactions (attractions) entre les groupements sulfonates (ROSO 3
− ) de la résine et les acides aminés protonés (chargés positivement). Les acides aminés sont ensuite entraînés
à travers la colonne à l’aide d’une solution tampon à pH prédéterminé et dont la valeur
La solubilité dans l’eau d’un
peptide ou d’une protéine
dépend de la charge effective
moyenne de leurs molécules
et elle est fonction du pH.
Plus cette charge est élevée,
plus le caractère ionique des
molécules est élevé, et plus la
solvatation par l’eau est ef?cace. La forme zwitterionique,
de charge nulle, est la forme
pour laquelle la solvatation
est minimale.
REMARQUE
L’urée et le chlorure de guanidinium (agents chaotropiques) interfèrent avec les
interactions intermoléculaires
non covalentes des polypeptides (ponts hydrogène,
interactions hydrophobes)
sans rupture des liaisons peptidiques. Cette action cause la
désorganisation de la structure
spatiale (ou dénaturation) de
la chaîne peptidique, qui se
trouve alors partiellement
ou totalement dépliée.
REMARQUE
6.7 Propriétés physiques des peptides et des protéines
275
d’une protéine changent radicalement lorsque le pH de la solution aqueuse devient
égal au point isoélectrique. La forme zwitterionique (de charge nulle) est alors majoritairement prépondérante et la solubilité dans l’eau est minimale. Cette propriété est
d’ailleurs mise à pro?t pour la précipitation sélective (en ajustant le pH) d’une protéine
particulière à partir d’un mélange donné.
Exemple 6.5
Décrivez l’isolation de la caséine à partir d’une solution aqueuse contenant
également de la trypsine et du lysozyme.
Solution
La caséine, la trypsine et le lysozyme ont des pI respectifs de 4,6, 10,8 et 11,0. L’ajustement
du pH de la solution à 4,6 provoque la précipitation de la caséine, alors que les deux autres
protéines y sont encore solubles. La caséine peut donc être isolée par une simple ?ltration.
6.7.2 Détermination de la composition en acides aminés
Après avoir déterminé la masse molaire et le pI d’un peptide ou d’une protéine, l’étape
suivante consiste à déterminer la composition en acides aminés, c’est-à-dire l’identi?cation de tous les acides aminés constituant le peptide ou la protéine, ainsi que leur
nombre. L’hydrolyse d’un peptide ou d’une protéine permet de briser la majorité des
liens peptidiques et d’obtenir un mélange de tous les acides aminés le constituant.
Avant d’effectuer cette hydrolyse, il faut toutefois tenir compte du fait que les peptides et les protéines sont présents dans la nature sous forme d’assemblages qu’il faut
briser pour avoir accès aux chaînes ou aux cycles individuels. Un traitement avec
une solution d’urée ou de chlorure de guanidinium clive les liaisons non covalentes
(principalement les ponts hydrogène) entre les chaînes ou les cycles, et permet d’accéder à des versions monomoléculaires de ces derniers. Dans un deuxième temps, il
faut s’assurer de réduire les ponts disulfure par un traitement au 2-mercaptoéthanol
(HSCH 2 CH 2 OH), lequel sera suivi d’un traitement à l’acide iodoéthanoïque a?n de
bloquer les extrémités thiols libres (voir la ?gure 6.25).
Figure 6.25 Réduction et inactivation des ponts disulfure d’un peptide ou d’une protéine
Après ces traitements préliminaires, l’hydrolyse du peptide ou de la protéine est
effectuée à l’aide de HCl 6 mol/L à reux pendant 24 à 48 heures. Le mélange d’acides
aminés est ensuite séparé par chromatographie. Les techniques chromatographiques
de séparation des acides aminés sont aujourd’hui automatisées, ce qui simpli?e grandement le processus. L’échantillon du mélange à puri?er est déposé sur une colonne
contenant une résine échangeuse d’ions (c’est-à-dire un polymère insoluble contenant
des groupements fonctionnels fortement acides tels les acides sulfoniques, ROSO 3 H).
Les groupements acides de la résine protonent les acides aminés, causant ainsi des interactions (attractions) entre les groupements sulfonates (ROSO 3
− ) de la résine et les acides aminés protonés (chargés positivement). Les acides aminés sont ensuite entraînés
à travers la colonne à l’aide d’une solution tampon à pH prédéterminé et dont la valeur
La solubilité dans l’eau d’un
peptide ou d’une protéine
dépend de la charge effective
moyenne de leurs molécules
et elle est fonction du pH.
Plus cette charge est élevée,
plus le caractère ionique des
molécules est élevé, et plus la
solvatation par l’eau est ef?cace. La forme zwitterionique,
de charge nulle, est la forme
pour laquelle la solvatation
est minimale.
REMARQUE
L’urée et le chlorure de guanidinium (agents chaotropiques) interfèrent avec les
interactions intermoléculaires
non covalentes des polypeptides (ponts hydrogène,
interactions hydrophobes)
sans rupture des liaisons peptidiques. Cette action cause la
désorganisation de la structure
spatiale (ou dénaturation) de
la chaîne peptidique, qui se
trouve alors partiellement
ou totalement dépliée.
REMARQUE
6.7 Propriétés physiques des peptides et des protéines
275