9.3
A Walk Through Selected Solution Studies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 410
9.3.1
Sucrose Gradient Rate Zonal Ultracentrifugation . . . . . . . . . . . . . . . . . 411
9.3.2
Size Exclusion Chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 417
9.3.3
Blue-Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis . . . . . . . . . . . . . . . . . 419
9.3.4
Chemical Cross-Linking . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 421
9.3.5
Electron Resonance Spectroscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 421
9.3.6
Determination of Rotational Correlation Times by Solution NMR . . . . 422
9.3.7
Analytical Ultracentrifugation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 423
9.3.8
Small-Angle X-ray and Neutron Solution Scattering . . . . . . . . . . . . . . . 426
9.3.8.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 426
9.3.8.2 Small-Angle Neutron Scattering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 432
9.3.8.3 Small-Angle X-ray Scattering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 437
9.3.9
Dynamic Light Scattering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 438
9.4
Conclusions and Prospects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 439
9.5
Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 440
9.5.1
Protocol 9.1: Analytical Ultracentrifugation of Membrane
Protein/Amphipol Complexes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 440
9.5.1.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 440
9.5.1.2 Instrumentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 441
9.5.1.3 Designing the Samples and Experiments . . . . . . . . . . . . . . . . 441
9.5.1.4 Compiling the Parameters That Will Be Required
for the Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 442
9.5.1.5 Running SV Experiments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 442
9.5.1.6 c(s) Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 442
9.5.2
Protocol 9.2: Size Exclusion Chromatography Analysis of Membrane
Protein/Amphipol Complexes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 444
9.5.2.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 444
9.5.2.2 Biochemistry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 444
9.5.2.3 Size Exclusion Chromatography System . . . . . . . . . . . . . . . . . 445
9.5.2.4 Buffers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 445
9.5.2.5 Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 446
9.5.2.6 Commented Examples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 446
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 448
10 Nuclear Magnetic Resonance Studies of Amphipol-Trapped Membrane Proteins . . . 453
10.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 453
10.2 Context: Solution NMR Studies of Membrane Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 455
10.2.1 Producing the Protein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 455
10.2.2 Membrane Protein/Surfactant Complexes Suitable for Solution NMR . . . 456
10.3 Solution NMR Studies of Amphipol-Trapped Membrane Proteins . . . . . . . . . . . . 461
10.3.1 Validating and Developing the Methodology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 463
10.3.1.1 Validating the Use of Amphipols for sNMR and Resolution
of the Spectra as Compared with Those Obtained
in Detergent Solutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 465
10.3.1.2 Mapping Membrane Protein/Amphipol Interactions
by NMR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 469
10.3.2 Developing pH-Insensitive and Fully Deuterated Amphipols . . . . . . . . . . 473
10.3.2.1 pH-Insensitive Amphipols and Their Use in sNMR . . . . . . . . . 473
10.3.2.2 Deuterated Amphipols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 479
xxii
Contents
A Walk Through Selected Solution Studies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 410
9.3.1
Sucrose Gradient Rate Zonal Ultracentrifugation . . . . . . . . . . . . . . . . . 411
9.3.2
Size Exclusion Chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 417
9.3.3
Blue-Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis . . . . . . . . . . . . . . . . . 419
9.3.4
Chemical Cross-Linking . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 421
9.3.5
Electron Resonance Spectroscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 421
9.3.6
Determination of Rotational Correlation Times by Solution NMR . . . . 422
9.3.7
Analytical Ultracentrifugation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 423
9.3.8
Small-Angle X-ray and Neutron Solution Scattering . . . . . . . . . . . . . . . 426
9.3.8.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 426
9.3.8.2 Small-Angle Neutron Scattering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 432
9.3.8.3 Small-Angle X-ray Scattering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 437
9.3.9
Dynamic Light Scattering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 438
9.4
Conclusions and Prospects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 439
9.5
Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 440
9.5.1
Protocol 9.1: Analytical Ultracentrifugation of Membrane
Protein/Amphipol Complexes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 440
9.5.1.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 440
9.5.1.2 Instrumentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 441
9.5.1.3 Designing the Samples and Experiments . . . . . . . . . . . . . . . . 441
9.5.1.4 Compiling the Parameters That Will Be Required
for the Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 442
9.5.1.5 Running SV Experiments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 442
9.5.1.6 c(s) Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 442
9.5.2
Protocol 9.2: Size Exclusion Chromatography Analysis of Membrane
Protein/Amphipol Complexes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 444
9.5.2.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 444
9.5.2.2 Biochemistry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 444
9.5.2.3 Size Exclusion Chromatography System . . . . . . . . . . . . . . . . . 445
9.5.2.4 Buffers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 445
9.5.2.5 Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 446
9.5.2.6 Commented Examples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 446
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 448
10 Nuclear Magnetic Resonance Studies of Amphipol-Trapped Membrane Proteins . . . 453
10.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 453
10.2 Context: Solution NMR Studies of Membrane Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 455
10.2.1 Producing the Protein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 455
10.2.2 Membrane Protein/Surfactant Complexes Suitable for Solution NMR . . . 456
10.3 Solution NMR Studies of Amphipol-Trapped Membrane Proteins . . . . . . . . . . . . 461
10.3.1 Validating and Developing the Methodology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 463
10.3.1.1 Validating the Use of Amphipols for sNMR and Resolution
of the Spectra as Compared with Those Obtained
in Detergent Solutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 465
10.3.1.2 Mapping Membrane Protein/Amphipol Interactions
by NMR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 469
10.3.2 Developing pH-Insensitive and Fully Deuterated Amphipols . . . . . . . . . . 473
10.3.2.1 pH-Insensitive Amphipols and Their Use in sNMR . . . . . . . . . 473
10.3.2.2 Deuterated Amphipols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 479
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Contents