6
Amphipol-Assisted Folding of Membrane Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333
6.1
Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333
6.2
Context: Existing Approaches to Folding Membrane Proteins In Vitro . . . . . . . . 334
6.3
Amphipol-Assisted Folding of Membrane Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338
6.3.1
Which Membrane Proteins Have Been Folded in Amphipols and How . . 338
6.3.1.1 Amphipol-Assisted Folding of α-Helical Membrane Proteins . . 339
6.3.1.1.1 Folding of BR in A8-35 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 339
6.3.1.1.2 A8-35-Assisted Folding of GPCRs . . . . . . . . . . . . 343
6.3.1.1.3 Folding of α-Helical Membrane Proteins
in Non-ionic Amphipols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 345
6.3.1.2 Amphipol-Assisted Folding of β-Barrel Membrane Proteins . . . 346
6.3.1.2.1 Folding of OmpA and FomA in A8-35 . . . . . . . . . 347
6.3.1.2.2 Folding of tOmpA, OmpT, and PagP . . . . . . . . . . . 348
6.3.1.2.3 Kinetics and Thermodynamics of Folding
OmpA in A8-35 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 349
6.3.2
Why Are Amphipols a Good Medium for Membrane Protein
Folding? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350
6.3.3
Challenges and Prospects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 353
6.4
Protocol 6.1. Amphipol-Assisted Folding of Membrane Proteins . . . . . . . . . . . . 354
6.4.1
Solubilization and Purification of MPs in Denaturing Conditions . . . . . . 354
6.4.2
Renaturation of α-Helical MPs in APols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 355
6.4.3
Renaturation of β-Barrel MPs in APols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 356
6.4.4
Completing the Renaturation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 356
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 356
7
Amphipol-Assisted Cell-Free Expression of Membrane Proteins . . . . . . . . . . . . . . . 361
7.1
Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 361
7.2
Context: Cell-Free Expression of Membrane Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363
7.3
Cell-Free Expression of Membrane Proteins Using Amphipols and Other
Amphipathic Polymers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 365
7.4
Conclusions and Perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 373
7.5
Protocol 7.1: Cell-Free Expression of Membrane Proteins in the Presence
of Non-ionic Amphipols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 375
7.5.1
Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 375
7.5.2
Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 375
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 376
8
Optical Spectroscopy of Membrane Protein/Amphipol Complexes . . . . . . . . . . . . . 381
8.1
Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 381
8.2
Optical Spectroscopy Studies of Amphipols and Membrane Protein/
Amphipol Complexes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 382
8.2.1
Circular Dichroism and Synchrotron Radiation Circular Dichroism . . . . 391
8.2.2
Infrared and Raman Spectroscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 394
8.2.3
Fluorescence Spectroscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 397
8.3
Conclusions and Prospects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 400
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 401
9
Solution Studies of Membrane Protein/Amphipol Complexes . . . . . . . . . . . . . . . . . 405
9.1
Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 406
9.2
Overview of the Literature . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 409
Contents
xxi
Amphipol-Assisted Folding of Membrane Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333
6.1
Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333
6.2
Context: Existing Approaches to Folding Membrane Proteins In Vitro . . . . . . . . 334
6.3
Amphipol-Assisted Folding of Membrane Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338
6.3.1
Which Membrane Proteins Have Been Folded in Amphipols and How . . 338
6.3.1.1 Amphipol-Assisted Folding of α-Helical Membrane Proteins . . 339
6.3.1.1.1 Folding of BR in A8-35 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 339
6.3.1.1.2 A8-35-Assisted Folding of GPCRs . . . . . . . . . . . . 343
6.3.1.1.3 Folding of α-Helical Membrane Proteins
in Non-ionic Amphipols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 345
6.3.1.2 Amphipol-Assisted Folding of β-Barrel Membrane Proteins . . . 346
6.3.1.2.1 Folding of OmpA and FomA in A8-35 . . . . . . . . . 347
6.3.1.2.2 Folding of tOmpA, OmpT, and PagP . . . . . . . . . . . 348
6.3.1.2.3 Kinetics and Thermodynamics of Folding
OmpA in A8-35 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 349
6.3.2
Why Are Amphipols a Good Medium for Membrane Protein
Folding? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350
6.3.3
Challenges and Prospects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 353
6.4
Protocol 6.1. Amphipol-Assisted Folding of Membrane Proteins . . . . . . . . . . . . 354
6.4.1
Solubilization and Purification of MPs in Denaturing Conditions . . . . . . 354
6.4.2
Renaturation of α-Helical MPs in APols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 355
6.4.3
Renaturation of β-Barrel MPs in APols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 356
6.4.4
Completing the Renaturation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 356
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 356
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Amphipol-Assisted Cell-Free Expression of Membrane Proteins . . . . . . . . . . . . . . . 361
7.1
Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 361
7.2
Context: Cell-Free Expression of Membrane Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363
7.3
Cell-Free Expression of Membrane Proteins Using Amphipols and Other
Amphipathic Polymers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 365
7.4
Conclusions and Perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 373
7.5
Protocol 7.1: Cell-Free Expression of Membrane Proteins in the Presence
of Non-ionic Amphipols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 375
7.5.1
Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 375
7.5.2
Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 375
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 376
8
Optical Spectroscopy of Membrane Protein/Amphipol Complexes . . . . . . . . . . . . . 381
8.1
Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 381
8.2
Optical Spectroscopy Studies of Amphipols and Membrane Protein/
Amphipol Complexes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 382
8.2.1
Circular Dichroism and Synchrotron Radiation Circular Dichroism . . . . 391
8.2.2
Infrared and Raman Spectroscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 394
8.2.3
Fluorescence Spectroscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 397
8.3
Conclusions and Prospects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 400
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 401
9
Solution Studies of Membrane Protein/Amphipol Complexes . . . . . . . . . . . . . . . . . 405
9.1
Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 406
9.2
Overview of the Literature . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 409
Contents
xxi