2.2.3 Resolution and Thick Sample Effects . . . . . . . . . . . . . . 39
2.2.4 Elemental Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.3 STEM Tomography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.3.1 Historical Background . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.3.2 STEM Tomography of Thick Plastic-Embedded
Sections . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
2.3.3 Cryo-STEM Tomography for Vitrified, Unstained
Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
2.3.4 CSTET and Elemental Analysis of Bacteria . . . . . . . . . 47
2.3.5 CSTET and Elemental Analysis
of Eukaryotic Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
2.4 Conclusions and Future Prospects. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
2.5 STEM Tomography Experimental Setup at the Weizmann
Institute. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
2.5.1 CSTET data collection protocol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
2.5.2 Plastic section data collection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
References. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3 Electron Cryo-Tomography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
Josie L. Ferreira, Teige R. S. Matthews-Palmer and Morgan Beeby
3.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
3.2 ECT: Overview and Key Concepts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
3.3 Specimen Preparation for ECT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
3.3.1 Vitrifying Thin Specimens: Plunge-Freezing . . . . . . . . . 66
3.3.2 Vitrifying Thick Specimens: Strategies Towards
Tractability . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
3.4 Tilt Series Acquisition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
3.4.1 Hardware Configuration. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
3.4.2 Data Acquisition Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
3.4.3 Data Collection: Electron Dose Considerations . . . . . . . 73
3.4.4 Data Collection: Choosing Microscope Defocus . . . . . . 74
3.4.5 Data Collection: Magnification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
3.4.6 Data Collection: Tilt Scheme Considerations. . . . . . . . . 74
3.4.7 Data Collection: Energy Filters and Phase Plates . . . . . 77
3.5 Tomogram Reconstruction: From Tilt Series Data to
Biological Insights . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
3.5.1 Alignment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
3.5.2 Reconstruction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
3.5.3 Post-processing to Maximize Signal in Tomograms . . . 79
3.5.4 Visualization and Interpretation of Denoised
Tomograms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
3.6 Examples of ECT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
3.6.1 Bacterial Cell Shape Maintenance . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
3.6.2 The Eukaryotic Nuclear Pore Complex . . . . . . . . . . . . . 84
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Contents