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Acides sialiques et oligosaccharides sialylés
phorylé ; le nucléotide sucre est un phosphodiester au lieu d’un pyrophosphate
(voir le paragraphe 10.4), la réaction est irréversible et la liaison est P. L‘enzyme
synthétase est isolable à partir de cervelle de veau achetée dans une boucherie[*l
L‘enzyme de E. coli a été clonée et surexprimée dans une souche de E. coli, dont
elle représente 10 % des protéines solubles[19] [20]. Elle admet comme substrat les
acides neuraminiques modifiés, Neu5Gc et Neu5,9Ac2 et, avec une efficacité
moindre, KDN. La réaction (12.4) consomme une quantité stoechiométrique de
CTP, produit rare et couteux. On part donc du nucléotide phosphate commun cytidine monophosphate, qui est phosphorylé deux fois, selon les réactions (12.5) et
(1 2.6). La première phosphorylation, avec ATP, est catalysée par l’enzyme
nucléoside monosphosphate kinase. En raison du prix de ATP, il faut la coupler
avec une réaction de régénération de ATP qui est la réaction traditionnelle de la
biochimie, (1 2.7), catalysée par l’enzyme pyruvate kinase. La phosphorylation de
CDP en CTP est possible directement par le phosphoenolpyruvate et la pyruvate
kinase. En plus des deux kinases et de la synthétase, on utilise une pyrophosphatase inorganique pour hydrolyser le pyrophosphate formé dans la réaction (12.4)
et la rendre irréversible. On immobilise séparément les quatre enzymes sur agarose et on mélange les gels, en suspension dans une solution aqueuse au pH 7,5
dans le réacteur. Ce système, alimenté en cytidine monophosphate, acide sialique
et phosphoenolpyruvate et en présence de quantités catalytiques d’ ATP, fabrique
le nucléotide sucre que l’on peut extraire du milieu, après séparation des gels par
filtration. La figure 12.1 schématise les réactions enzymatiques couplées dans le
réacteur. On observe les rendements suivants12] : CMP-Neu5Ac : 60 % ; CMPNeu5Gc : 80 % ; CMP - Neu5,9Ac2 : 52 % : CMP-KDN : 26 %.
(12.5) CMP + ATP - ADP + CDP
(12.6) CDP + phosphoénolpyruvate - CTP + pyruvate
(12.7) ADP + phosphoénolpyruvate - ATP + pyruvate
L‘étape suivante est le couplage sur le sucre accepteur, qui a lieu avec libération de CMP, catalysée par une siczlyltransfevase, présentée selon le mode de la
biochimie sur la figure 12.2. Les sialyltransférases introduisent une unité sialyl
sous la forme a-D-pyranosyl sur un sucre en situation terminale non réductrice
dans un oligosaccharide. Les exemples que nous donnerons ci-dessous mettront
en évidence la nature de leur spécificité.
La plus commune introduit le résidu a-D-sialopyranosyl sur la position primaire du galactose dans le méthyl P-D-galactopyranoside, le méthyl P-lactoside
et la N-acétyl-lactosamine libre ou en position terminale non réductrice dans un
oligosaccharide. Elle est abondante dans le foie de porc, disponible en boucherie.
Sous forme immobilisée, elle a permis de préparer le tétrasaccharide glycoside
12.21a, dont l’enchaînement est fréquent dans les glycoprotéines[211. Les trois
couplages osidiques de 12.21a ont été réalisés de trois façons différentes, le pre-
Acides sialiques et oligosaccharides sialylés
phorylé ; le nucléotide sucre est un phosphodiester au lieu d’un pyrophosphate
(voir le paragraphe 10.4), la réaction est irréversible et la liaison est P. L‘enzyme
synthétase est isolable à partir de cervelle de veau achetée dans une boucherie[*l
L‘enzyme de E. coli a été clonée et surexprimée dans une souche de E. coli, dont
elle représente 10 % des protéines solubles[19] [20]. Elle admet comme substrat les
acides neuraminiques modifiés, Neu5Gc et Neu5,9Ac2 et, avec une efficacité
moindre, KDN. La réaction (12.4) consomme une quantité stoechiométrique de
CTP, produit rare et couteux. On part donc du nucléotide phosphate commun cytidine monophosphate, qui est phosphorylé deux fois, selon les réactions (12.5) et
(1 2.6). La première phosphorylation, avec ATP, est catalysée par l’enzyme
nucléoside monosphosphate kinase. En raison du prix de ATP, il faut la coupler
avec une réaction de régénération de ATP qui est la réaction traditionnelle de la
biochimie, (1 2.7), catalysée par l’enzyme pyruvate kinase. La phosphorylation de
CDP en CTP est possible directement par le phosphoenolpyruvate et la pyruvate
kinase. En plus des deux kinases et de la synthétase, on utilise une pyrophosphatase inorganique pour hydrolyser le pyrophosphate formé dans la réaction (12.4)
et la rendre irréversible. On immobilise séparément les quatre enzymes sur agarose et on mélange les gels, en suspension dans une solution aqueuse au pH 7,5
dans le réacteur. Ce système, alimenté en cytidine monophosphate, acide sialique
et phosphoenolpyruvate et en présence de quantités catalytiques d’ ATP, fabrique
le nucléotide sucre que l’on peut extraire du milieu, après séparation des gels par
filtration. La figure 12.1 schématise les réactions enzymatiques couplées dans le
réacteur. On observe les rendements suivants12] : CMP-Neu5Ac : 60 % ; CMPNeu5Gc : 80 % ; CMP - Neu5,9Ac2 : 52 % : CMP-KDN : 26 %.
(12.5) CMP + ATP - ADP + CDP
(12.6) CDP + phosphoénolpyruvate - CTP + pyruvate
(12.7) ADP + phosphoénolpyruvate - ATP + pyruvate
L‘étape suivante est le couplage sur le sucre accepteur, qui a lieu avec libération de CMP, catalysée par une siczlyltransfevase, présentée selon le mode de la
biochimie sur la figure 12.2. Les sialyltransférases introduisent une unité sialyl
sous la forme a-D-pyranosyl sur un sucre en situation terminale non réductrice
dans un oligosaccharide. Les exemples que nous donnerons ci-dessous mettront
en évidence la nature de leur spécificité.
La plus commune introduit le résidu a-D-sialopyranosyl sur la position primaire du galactose dans le méthyl P-D-galactopyranoside, le méthyl P-lactoside
et la N-acétyl-lactosamine libre ou en position terminale non réductrice dans un
oligosaccharide. Elle est abondante dans le foie de porc, disponible en boucherie.
Sous forme immobilisée, elle a permis de préparer le tétrasaccharide glycoside
12.21a, dont l’enchaînement est fréquent dans les glycoprotéines[211. Les trois
couplages osidiques de 12.21a ont été réalisés de trois façons différentes, le pre-