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Toxicologie nucléaire environnementale et humaine
Depuis les derniers développements des technologies de transgénèses (Mello et
al., 1991), de nouvelles souches de nématodes modifiés (Candido et Jones, 1996)
ont commencé à lever cette limitation en offrant à l’analyse de nouveaux biodétecteurs dont la spécificité est en constante évolution. Le recours au marquage
GFP (Chalfie et al., 1994) a, par la suite, contribué à améliorer les modèles transgéniques et installé le nématode comme le modèle pluricellulaire offrant le plus
de solutions aux développeurs (Link et al., 1999).
4.1. Ingénierie moléculaire chez C. elegans
Les techniques classiques d’obtention de nématodes transgéniques utilisaient
auparavant de fastidieuses micro-injections pratiquées au microscope (Araiz et al.,
2008). Ces manipulations sont maintenant remplacées par des bombardements de
préparations d’ADN adsorbé sur des particules nanométriques d’or colloïdal, avec
des dispositifs de type arbalètes ou encore « gene gun » (seul modèle commercial
actuellement disponible, le Biolistic PDS-1000/He System, BioRad; Araiz et al.,
2008). Ce type de dispositif rend accessible à tout laboratoire de biologie moléculaire l’obtention de ses propres transgènes. Comme pour les biodétecteurs bactériens, plusieurs stratégies peuvent être envisagées pour l’expression d’un gène
rapporteur fluorescent comme la GFP; directement sous contrôle d’un promoteur
inductible ou constitutif, en fusion avec une séquence codante, etc.
Notons qu’il existe des séquences de « enhanced GFP » (eGFP) spécialement
optimisées pour le nématode, mais toutes les eGFP fonctionnent très bien dans
ce système. Les variants comme DsRed présentent également un intérêt pour
certaines études, à l’image du variant « P-timer », Invitrogen Inc., connu pour sa
persistance (« life time GFP »). Celui-ci a la particularité de voir sa fluorescence
évoluer du vert au rouge en cinq heures (Terskikh et al., 2000), donnant ainsi
accès à des observations résolues dans le temps. Ainsi, c’est à la fois le niveau et
la durée de 1 induction peuvent être approchés. Ceci peut être très intéressant dans
des analyses de type High content screening (HCS) décrites ci-après.
4.2. Biodétecteurs C. elegans : sélectivité versus sensibilité
s
■o
c
Quelques gènes de la « heat shock response » (hsp) furent initialement
proposés pour la détection de métaux lourds (Mutwakil et al., 1997; Link et al., |
1999). Par exemple, l’expression de hsp-16 permet de mesurer des réponses dépen- ।
dantes de la dose dès huit heures d’exposition à des sels de métaux solubles de Cd, §
Cu, Hg, As ou Pb (Stringham et Candido, 1994). Des effets synergiques entre |
métaux peuvent être observables par de tels outils (Wah et Chow, 2002). Toute- ।
fois, les biodétecteurs à base Hsp s’avèrent peu spécifiques d’un métal donné, f
et de nouvelles recherches sont nécessaires afin de trouver un bon compromis -y
entre spécificité et sensibilité. À cet égard, les résultats du groupe de Jonathan |
Freedman sont intéressants; le gène cdr-1 répond spécifiquement au Cd, mais ni j
au Hg, Cu ou Zn (Hsiu-Chuan et al., 2002), le promoteur de la métallothionine-2
Toxicologie nucléaire environnementale et humaine
Depuis les derniers développements des technologies de transgénèses (Mello et
al., 1991), de nouvelles souches de nématodes modifiés (Candido et Jones, 1996)
ont commencé à lever cette limitation en offrant à l’analyse de nouveaux biodétecteurs dont la spécificité est en constante évolution. Le recours au marquage
GFP (Chalfie et al., 1994) a, par la suite, contribué à améliorer les modèles transgéniques et installé le nématode comme le modèle pluricellulaire offrant le plus
de solutions aux développeurs (Link et al., 1999).
4.1. Ingénierie moléculaire chez C. elegans
Les techniques classiques d’obtention de nématodes transgéniques utilisaient
auparavant de fastidieuses micro-injections pratiquées au microscope (Araiz et al.,
2008). Ces manipulations sont maintenant remplacées par des bombardements de
préparations d’ADN adsorbé sur des particules nanométriques d’or colloïdal, avec
des dispositifs de type arbalètes ou encore « gene gun » (seul modèle commercial
actuellement disponible, le Biolistic PDS-1000/He System, BioRad; Araiz et al.,
2008). Ce type de dispositif rend accessible à tout laboratoire de biologie moléculaire l’obtention de ses propres transgènes. Comme pour les biodétecteurs bactériens, plusieurs stratégies peuvent être envisagées pour l’expression d’un gène
rapporteur fluorescent comme la GFP; directement sous contrôle d’un promoteur
inductible ou constitutif, en fusion avec une séquence codante, etc.
Notons qu’il existe des séquences de « enhanced GFP » (eGFP) spécialement
optimisées pour le nématode, mais toutes les eGFP fonctionnent très bien dans
ce système. Les variants comme DsRed présentent également un intérêt pour
certaines études, à l’image du variant « P-timer », Invitrogen Inc., connu pour sa
persistance (« life time GFP »). Celui-ci a la particularité de voir sa fluorescence
évoluer du vert au rouge en cinq heures (Terskikh et al., 2000), donnant ainsi
accès à des observations résolues dans le temps. Ainsi, c’est à la fois le niveau et
la durée de 1 induction peuvent être approchés. Ceci peut être très intéressant dans
des analyses de type High content screening (HCS) décrites ci-après.
4.2. Biodétecteurs C. elegans : sélectivité versus sensibilité
s
■o
c
Quelques gènes de la « heat shock response » (hsp) furent initialement
proposés pour la détection de métaux lourds (Mutwakil et al., 1997; Link et al., |
1999). Par exemple, l’expression de hsp-16 permet de mesurer des réponses dépen- ।
dantes de la dose dès huit heures d’exposition à des sels de métaux solubles de Cd, §
Cu, Hg, As ou Pb (Stringham et Candido, 1994). Des effets synergiques entre |
métaux peuvent être observables par de tels outils (Wah et Chow, 2002). Toute- ।
fois, les biodétecteurs à base Hsp s’avèrent peu spécifiques d’un métal donné, f
et de nouvelles recherches sont nécessaires afin de trouver un bon compromis -y
entre spécificité et sensibilité. À cet égard, les résultats du groupe de Jonathan |
Freedman sont intéressants; le gène cdr-1 répond spécifiquement au Cd, mais ni j
au Hg, Cu ou Zn (Hsiu-Chuan et al., 2002), le promoteur de la métallothionine-2