Nouveaux outils de détection et d'analyse
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dans les bases de données. Les spots de gels 2D, qui contiennent en général une
seule protéine sont couramment analysés ainsi.
Quand le mélange est plus complexe, le séquençage de chaque peptide se fait
par spectrométrie de masse dite « en tandem ». Un premier analyseur sélectionne
les ions les plus abondants ayant un m/z donné. Ces ions sont ensuite fragmentés
puis réanalysés. En utilisant les informations de masse de l’ion parent et des ions
fils, la protéine est identifiée par recherche dans les bases de données. Ces appareils sont généralement couplés en amont à une chaîne de nano chromatographie
qui permet de séparer les peptides en utilisant des colonnes à polarité de phase
inversée (phases stationnaires de type C18). À la sortie de la colonne, la solution
est introduite dans la source par l’intermédiaire d’un capillaire et elle est ionisée
dans une source d’électronébulisation à pression atmosphérique (source electrospray ou ESI). L’analyseur peut être dans ce cas un TOF, un piège ionique (ion trap
ou encore IT, en anglais) simple ou à transformée de Fourrier (FT-ICR, LTQOrbitrap).
Pour comparer les échantillons provenant d’un état « intoxiqué » et d’un état
« sain », la quantification relative des peptides analysés est nécessaire. Certaines
techniques utilisent le marquage : deux échantillons sont marqués avec des
isotopes stables différents, puis ils sont mélangés et analysés simultanément.
Chaque peptide est alors observé sous forme de deux pics sur le spectre et les
abondances relatives des pics reflètent la quantité des peptides dans chaque
échantillon. Les isotopes stables peuvent être incorporés in vivo par marquage
métabolique des protéines dans une culture cellulaire dans lesquelles sont
présentes des molécules contenant l’isotope 15N ou des acides aminés marqués
avec des isotopes stables (SILAC : stable isotope labeling by amino acids in cell
culture). Ils peuvent également être incorporés in vitro par marquage chimique de
groupes fonctionnels présents dans des molécules telles que les cystéines (ICAT .
isotope-coded affinity tags) ou les amines primaires (iTRAQ : isobai ic tags foi
relative and absolute quantitation) (Mueller et al., 2008).
En parallèle, la quantification sans marquage se développe depuis quelques
années. Le profil d’élution d’un peptide peut être représenté par le courant ionique
mesuré en fonction du temps. L’aire sous la courbe correspond au chiomatogramme de l’ion extrait (XIC pour extracted ion chromatogram) et est propor। tionnelle à la quantité de peptide. Une autre possibilité est le comptage spectial
3 (spectral counting), correspondant à la fréquence de détection d un peptide donné.
» Ce résultat est proportionnel à l’abondance du peptide dans 1 échantillon. Ces
I techniques permettent de réaliser des analyses différentielles en s affranchissant
” du biais du marquage (Mueller et al., 2008).
s
La quantification exacte est requise dans des domaines clefs tels que 1 analyse
| clinique avec l’évaluation de candidats biomarqueurs. Elle se réalise en ajoutant
| dans l’échantillon complexe à analyser une quantité connue d'un étalon interne
•j chimiquement identique au composé à doser, mais alourdi pai I incoiporation
। d’isotopes stables (AQUA, absolute quantification ou MRM, multiple reaction
§ monitoring) (Unwin et al., 2006).
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dans les bases de données. Les spots de gels 2D, qui contiennent en général une
seule protéine sont couramment analysés ainsi.
Quand le mélange est plus complexe, le séquençage de chaque peptide se fait
par spectrométrie de masse dite « en tandem ». Un premier analyseur sélectionne
les ions les plus abondants ayant un m/z donné. Ces ions sont ensuite fragmentés
puis réanalysés. En utilisant les informations de masse de l’ion parent et des ions
fils, la protéine est identifiée par recherche dans les bases de données. Ces appareils sont généralement couplés en amont à une chaîne de nano chromatographie
qui permet de séparer les peptides en utilisant des colonnes à polarité de phase
inversée (phases stationnaires de type C18). À la sortie de la colonne, la solution
est introduite dans la source par l’intermédiaire d’un capillaire et elle est ionisée
dans une source d’électronébulisation à pression atmosphérique (source electrospray ou ESI). L’analyseur peut être dans ce cas un TOF, un piège ionique (ion trap
ou encore IT, en anglais) simple ou à transformée de Fourrier (FT-ICR, LTQOrbitrap).
Pour comparer les échantillons provenant d’un état « intoxiqué » et d’un état
« sain », la quantification relative des peptides analysés est nécessaire. Certaines
techniques utilisent le marquage : deux échantillons sont marqués avec des
isotopes stables différents, puis ils sont mélangés et analysés simultanément.
Chaque peptide est alors observé sous forme de deux pics sur le spectre et les
abondances relatives des pics reflètent la quantité des peptides dans chaque
échantillon. Les isotopes stables peuvent être incorporés in vivo par marquage
métabolique des protéines dans une culture cellulaire dans lesquelles sont
présentes des molécules contenant l’isotope 15N ou des acides aminés marqués
avec des isotopes stables (SILAC : stable isotope labeling by amino acids in cell
culture). Ils peuvent également être incorporés in vitro par marquage chimique de
groupes fonctionnels présents dans des molécules telles que les cystéines (ICAT .
isotope-coded affinity tags) ou les amines primaires (iTRAQ : isobai ic tags foi
relative and absolute quantitation) (Mueller et al., 2008).
En parallèle, la quantification sans marquage se développe depuis quelques
années. Le profil d’élution d’un peptide peut être représenté par le courant ionique
mesuré en fonction du temps. L’aire sous la courbe correspond au chiomatogramme de l’ion extrait (XIC pour extracted ion chromatogram) et est propor। tionnelle à la quantité de peptide. Une autre possibilité est le comptage spectial
3 (spectral counting), correspondant à la fréquence de détection d un peptide donné.
» Ce résultat est proportionnel à l’abondance du peptide dans 1 échantillon. Ces
I techniques permettent de réaliser des analyses différentielles en s affranchissant
” du biais du marquage (Mueller et al., 2008).
s
La quantification exacte est requise dans des domaines clefs tels que 1 analyse
| clinique avec l’évaluation de candidats biomarqueurs. Elle se réalise en ajoutant
| dans l’échantillon complexe à analyser une quantité connue d'un étalon interne
•j chimiquement identique au composé à doser, mais alourdi pai I incoiporation
। d’isotopes stables (AQUA, absolute quantification ou MRM, multiple reaction
§ monitoring) (Unwin et al., 2006).