Nouveaux outils de détection et d’ analyse
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2.1. Analyse du transcriptome
2.1.1. Les puces à ADN pour la toxicologie
Le principe des puces à ADN est fondé sur l’hybridation moléculaire de l’ADN
double brin sur un support solide (Northern Blot) appliqué à l’échelle du génome
entier selon la technique mise au point par P. Brown (DeRisi et al., 1997). Cette
technique est déjà largement utilisée en pharmacologie (pharmacogénomique)
pour anticiper les effets toxiques d’un candidat médicament en amont des études
cliniques, épargnant ainsi nombre d’animaux et des essais coûteux. Elle n’est
utilisée que depuis les années 2000 en Toxicologie environnementale, notamment
pour le cadmium (Momose et Iwahashi, 2001).
2.1.2. Différents types de lames
Il y a deux types de puces à ADN : celles préparées par dépôt d’une solution
d’acides nucléiques ou d’oligonucléotides (40-70 mers) appelés sondes, et celles
où la synthèse des oligonucléotides est réalisée in situ (Affymetrix, Agilent). Le
support solide peut être une lame de verre, avec silicium ou bien encore de plastique recouvert d’une membrane de nitrocellulose. Chaque dépôt correspond à un
gène identifié, leur nombre pouvant aller jusqu’à 300000 par lame.
2.1.3. Préparation des échantillons
Les échantillons à analyser (organes, tissus, cellule8, mélanges Ç°mp
environnementaux) doivent être traités de façon à extraire eui con ®
(acides ribonucléiques), représentant l’expression des Sen^s°us m mecsasers
toxique par comparaison à un état témoin. A partir des
o
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extraits du test ou du témoin, les cibles ADNc (acides deoxyribo bonucleiques
complémentaires) sont obtenues séparément pai transcription inve , cou]eurs
rant deux fluorochromes différents, en général Cy5 et y ( o
’
figure 4). Le mélange des deux cibles marquées permet d hybde rdejaçon
simultanée et compétitive les cibles provenant du test ou u
donnera
même sonde. Un excès du gène X dans l’échanti on marque
signal
> «
'
v jonc l’pchant Ion en vert donnera un signai
s un signal rouge; un exces du gene Y dans I ec
11
échantillons donnera
? vert; une expression équivalente du gene Z dans
fluorescence rouge/
| un signal jaune. On calcule ensuite le ratio des mtensi es
,
.
exnresi fluorescence verte pour chacun des spots ce qui permet erec
Généralement
i s10„ différentieUe Ses gènes dans les deux «on^e. d.e. Generalenrenl,
’ on fixe un seuil à ce ratio (supérieur a 2 ou i
r-moort à la
s considérer qu’un gène est sur- ou sous-exprimé dans a ci e
r chaque
8 cible témoin. On obtient ainsi une liste de gènes in uits ou i
néanmoins
| condition expérimentale d’exposition. La fiabilité des resu a
sophisti? sur l’obtention de réplicats et sur des analyses statistiques de plus en plus sophisti
| quées (Quackenbush, 2005).
ô
<0
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2.1. Analyse du transcriptome
2.1.1. Les puces à ADN pour la toxicologie
Le principe des puces à ADN est fondé sur l’hybridation moléculaire de l’ADN
double brin sur un support solide (Northern Blot) appliqué à l’échelle du génome
entier selon la technique mise au point par P. Brown (DeRisi et al., 1997). Cette
technique est déjà largement utilisée en pharmacologie (pharmacogénomique)
pour anticiper les effets toxiques d’un candidat médicament en amont des études
cliniques, épargnant ainsi nombre d’animaux et des essais coûteux. Elle n’est
utilisée que depuis les années 2000 en Toxicologie environnementale, notamment
pour le cadmium (Momose et Iwahashi, 2001).
2.1.2. Différents types de lames
Il y a deux types de puces à ADN : celles préparées par dépôt d’une solution
d’acides nucléiques ou d’oligonucléotides (40-70 mers) appelés sondes, et celles
où la synthèse des oligonucléotides est réalisée in situ (Affymetrix, Agilent). Le
support solide peut être une lame de verre, avec silicium ou bien encore de plastique recouvert d’une membrane de nitrocellulose. Chaque dépôt correspond à un
gène identifié, leur nombre pouvant aller jusqu’à 300000 par lame.
2.1.3. Préparation des échantillons
Les échantillons à analyser (organes, tissus, cellule8, mélanges Ç°mp
environnementaux) doivent être traités de façon à extraire eui con ®
(acides ribonucléiques), représentant l’expression des Sen^s°us m mecsasers
toxique par comparaison à un état témoin. A partir des
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extraits du test ou du témoin, les cibles ADNc (acides deoxyribo bonucleiques
complémentaires) sont obtenues séparément pai transcription inve , cou]eurs
rant deux fluorochromes différents, en général Cy5 et y ( o
’
figure 4). Le mélange des deux cibles marquées permet d hybde rdejaçon
simultanée et compétitive les cibles provenant du test ou u
donnera
même sonde. Un excès du gène X dans l’échanti on marque
signal
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s un signal rouge; un exces du gene Y dans I ec
11
échantillons donnera
? vert; une expression équivalente du gene Z dans
fluorescence rouge/
| un signal jaune. On calcule ensuite le ratio des mtensi es
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exnresi fluorescence verte pour chacun des spots ce qui permet erec
Généralement
i s10„ différentieUe Ses gènes dans les deux «on^e. d.e. Generalenrenl,
’ on fixe un seuil à ce ratio (supérieur a 2 ou i
r-moort à la
s considérer qu’un gène est sur- ou sous-exprimé dans a ci e
r chaque
8 cible témoin. On obtient ainsi une liste de gènes in uits ou i
néanmoins
| condition expérimentale d’exposition. La fiabilité des resu a
sophisti? sur l’obtention de réplicats et sur des analyses statistiques de plus en plus sophisti
| quées (Quackenbush, 2005).
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