CHLOROPHYLLE - FLUORIMÉTRIE
9. PURIFICATION DE LA CHLOROPHYLLE A PAR CHROMATOGRAPHIE
— Durée : 1,5 à 2 h.
— Matériel biologique utilisable :
On peut utiliser tout végétal autotrophe (sauf bactéries photosynthétiques) ; le plus simple est de prendre une feuille verte saine (Pélargonium ou
autres).
— Extraction des pigments :
Broyer environ 1 g de matériel dans quelques millilitres d'acétone à
100 % « pour analyse », soit à l’aide d’un broyeur de tissus, soit, plus simplement, par écrasement dans un mortier, en présence de sable de Fontainebleau.
La solution obtenue est éclaircie par filtration sur verre fritté ou laine de
verre. L’extraction est répétée trois fois.
— Précipitation de la chlorophylle a :
Ajouter un volume de dioxane correspondant au septième du volume de
l’extrait total et agiter. Ajouter, en agitant, goutte à goutte, de l’eau distillée
jusqu’à la formation d’un précipité (Iriyama et al., 1974) qui contient la
chlorophylle a et les carotènes (et aussi la chlorophylle b dans le cas d'un
matériel terrestre ou d’algues vertes). Après centrifugation et élimination du
surnageant qui contient les xanthophyllês, les pigments précipités sont repris
par 1 à 3 ml d’acétone. Agiter jusqu’à complète dissolution.
— Transfert des pigments dans l’éther de pétrole (40-60 °C) :
Ajouter à la solution acétonique de pigments un volume égal d’éther de
pétrole (40-60 °C). Le transfert se fait dans une petite ampoule à décanter
(100 ml) par partition avec de l’eau distillée ou une solution de NaCl dilué
(matériel terrestre ou eau douce) ou une solution de NaCl à 10% (matériel
marin). Répéter l’opération trois fois (élimination de l’acétone et de produits
hydrophiles). La phase éthéropétrolique est ensuite desséchée à l’aide de
cristaux de Na2SO4. Récupérer la solution (sans oublier d’assécher la tubulure
inférieure de l’ampoule avec un morceau de papier absorbant non pelucheux).
— Séparation des pigments par chromatographie sur colonne (Déroché,
1971) :
Prendre un tube effilé à un bout, de 14 mm de diamètre interne et de
20 cm de haut. Obturer avec un tampon de laine de verre la partie inférieure
effilée. Remplir la colonne aux deux tiers de cellulose whatman CF 11, en
la tassant avec une baguette de verre dont le diamètre est légèrement inférieur
à celui de l’intérieur du tube. La colonne est lavée par l’éther de pétrole (4060 °C) puis, avant l’assèchement du sommet de l’adsorbant, l’extrait de pigments est ajouté. Les carotènes sont immédiatement élués avec l’éther de
pétrole. Ensuite, des mélanges successifs acétone-éther de pétrole de plus
en plus polaires permettent de séparer le reste des pigments présents, dans
l’ordre suivant :
— (4/96) acétone/éther de pétrole (40-60 °C) : élution de la phéophytine a et de résidus de xanthophyllês,
— (6/94) acétone/éther de pétrole (40-60 °C) : élution de la chlorophylle a,
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9. PURIFICATION DE LA CHLOROPHYLLE A PAR CHROMATOGRAPHIE
— Durée : 1,5 à 2 h.
— Matériel biologique utilisable :
On peut utiliser tout végétal autotrophe (sauf bactéries photosynthétiques) ; le plus simple est de prendre une feuille verte saine (Pélargonium ou
autres).
— Extraction des pigments :
Broyer environ 1 g de matériel dans quelques millilitres d'acétone à
100 % « pour analyse », soit à l’aide d’un broyeur de tissus, soit, plus simplement, par écrasement dans un mortier, en présence de sable de Fontainebleau.
La solution obtenue est éclaircie par filtration sur verre fritté ou laine de
verre. L’extraction est répétée trois fois.
— Précipitation de la chlorophylle a :
Ajouter un volume de dioxane correspondant au septième du volume de
l’extrait total et agiter. Ajouter, en agitant, goutte à goutte, de l’eau distillée
jusqu’à la formation d’un précipité (Iriyama et al., 1974) qui contient la
chlorophylle a et les carotènes (et aussi la chlorophylle b dans le cas d'un
matériel terrestre ou d’algues vertes). Après centrifugation et élimination du
surnageant qui contient les xanthophyllês, les pigments précipités sont repris
par 1 à 3 ml d’acétone. Agiter jusqu’à complète dissolution.
— Transfert des pigments dans l’éther de pétrole (40-60 °C) :
Ajouter à la solution acétonique de pigments un volume égal d’éther de
pétrole (40-60 °C). Le transfert se fait dans une petite ampoule à décanter
(100 ml) par partition avec de l’eau distillée ou une solution de NaCl dilué
(matériel terrestre ou eau douce) ou une solution de NaCl à 10% (matériel
marin). Répéter l’opération trois fois (élimination de l’acétone et de produits
hydrophiles). La phase éthéropétrolique est ensuite desséchée à l’aide de
cristaux de Na2SO4. Récupérer la solution (sans oublier d’assécher la tubulure
inférieure de l’ampoule avec un morceau de papier absorbant non pelucheux).
— Séparation des pigments par chromatographie sur colonne (Déroché,
1971) :
Prendre un tube effilé à un bout, de 14 mm de diamètre interne et de
20 cm de haut. Obturer avec un tampon de laine de verre la partie inférieure
effilée. Remplir la colonne aux deux tiers de cellulose whatman CF 11, en
la tassant avec une baguette de verre dont le diamètre est légèrement inférieur
à celui de l’intérieur du tube. La colonne est lavée par l’éther de pétrole (4060 °C) puis, avant l’assèchement du sommet de l’adsorbant, l’extrait de pigments est ajouté. Les carotènes sont immédiatement élués avec l’éther de
pétrole. Ensuite, des mélanges successifs acétone-éther de pétrole de plus
en plus polaires permettent de séparer le reste des pigments présents, dans
l’ordre suivant :
— (4/96) acétone/éther de pétrole (40-60 °C) : élution de la phéophytine a et de résidus de xanthophyllês,
— (6/94) acétone/éther de pétrole (40-60 °C) : élution de la chlorophylle a,
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