Préparation et stérilisation du matériel et des milieux de culture
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2.1.2. Procédure de préparation des milieux de culture
2.1.2.1. Précautions d’utilisation des composants d’origine animale
Il s’agit principalement des extraits de viande, des peptones présents dans les
milieux de culture, mais aussi du lactose, des sels biliaires...
Il est maintenant clairement indiqué dans les fiches techniques des milieux de
culture des fabricants contenant de telles substances que : « La maîtrise de l’origine et/ou de l’état sanitaire des animaux ne pouvant garantir de façon absolue
que ces produits ne contiennent aucun agent pathogène transmissible, il est
recommandé de les manipuler avec les précautions d’usage relatives aux produits
potentiellement infectieux (ne pas ingérer, ne pas inhaler) » (bioMérieux SA).
2.1.2.2. Procédure générale de préparation des milieux de culture
Une procédure classique de préparation des milieux de culture en travaux pratiques est présentée dans le tableau 15. Elle doit être éventuellement adaptée aux
procédures de travail et d’utilisation des appareils existant dans le laboratoire.
Tableau 15 ■ Procédure classique de préparation des milieux de culture.
Procédure
Conseils pratiques
Eau distillée
Sur verre ou déminéralisée1 pour préparer
1 000 mL d’un milieu : mesurer 1 000 mL en
éprouvette graduée2
Dissoudre les substances dans un volume
d’eau < 1000 mL (à l'exception de la gélose
pour un milieu solide) et rajouter le volume
d'eau restant
Sur verre ou déminéralisée (1) pour préparer
un milieu qsp 1 000 mL :
prendre un volume d’eau < 1000 mL
Dissoudre les substances (à l’exception de la
gélose pour un milieu solide), puis compléter
à 1 000 mL en fiole jaugée
Substances à dissoudre
Pesées sur une balance de laboratoire ou
analytique selon les besoins2
Substances dissoutes à froid en respectant
l’ordre indiqué dans la composition du milieu
pH des milieux
• Si pH acide, solution HCl M à utiliser
• Si pH basique, solution NaOH M à employer
Ajuster le pH du milieu au pH mètre2 lorsque
toutes les substances ont été dissoutes et à
froid, avant le chauffage et l’addition de
gélose (pour les milieux solides)
Gélose ou agar-agar
A ajouter au milieu dès le début du chauffage
ou commencer à chauffer l'eau, puis verser la
gélose
Agiter constamment le milieu jusqu'à dissolution complète de la gélose, puis laisser bouillir
1 à 2 minutes
Ou homogénéiser à froid et mettre au microondes (7 minutes environ par litre de milieu à
1000 W)2
Attention ! Ne pas homogénéiser le milieu à
sa sortie du micro-ondes (retard d'ébullition
possible donc risque de brûlure)
1. Contrôle de conductivité : < 25 pS/cm à + 25 °C (cf. programme n° 100-2 « Analyses biologiques et microbiologiques des eaux » du Cofrac).
2. Matériel et récipients intervenant dans la préparation des milieux de culture (cf. première partie, chapitre 2
« Matériel principal du laboratoire de microbiologie).
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2.1.2. Procédure de préparation des milieux de culture
2.1.2.1. Précautions d’utilisation des composants d’origine animale
Il s’agit principalement des extraits de viande, des peptones présents dans les
milieux de culture, mais aussi du lactose, des sels biliaires...
Il est maintenant clairement indiqué dans les fiches techniques des milieux de
culture des fabricants contenant de telles substances que : « La maîtrise de l’origine et/ou de l’état sanitaire des animaux ne pouvant garantir de façon absolue
que ces produits ne contiennent aucun agent pathogène transmissible, il est
recommandé de les manipuler avec les précautions d’usage relatives aux produits
potentiellement infectieux (ne pas ingérer, ne pas inhaler) » (bioMérieux SA).
2.1.2.2. Procédure générale de préparation des milieux de culture
Une procédure classique de préparation des milieux de culture en travaux pratiques est présentée dans le tableau 15. Elle doit être éventuellement adaptée aux
procédures de travail et d’utilisation des appareils existant dans le laboratoire.
Tableau 15 ■ Procédure classique de préparation des milieux de culture.
Procédure
Conseils pratiques
Eau distillée
Sur verre ou déminéralisée1 pour préparer
1 000 mL d’un milieu : mesurer 1 000 mL en
éprouvette graduée2
Dissoudre les substances dans un volume
d’eau < 1000 mL (à l'exception de la gélose
pour un milieu solide) et rajouter le volume
d'eau restant
Sur verre ou déminéralisée (1) pour préparer
un milieu qsp 1 000 mL :
prendre un volume d’eau < 1000 mL
Dissoudre les substances (à l’exception de la
gélose pour un milieu solide), puis compléter
à 1 000 mL en fiole jaugée
Substances à dissoudre
Pesées sur une balance de laboratoire ou
analytique selon les besoins2
Substances dissoutes à froid en respectant
l’ordre indiqué dans la composition du milieu
pH des milieux
• Si pH acide, solution HCl M à utiliser
• Si pH basique, solution NaOH M à employer
Ajuster le pH du milieu au pH mètre2 lorsque
toutes les substances ont été dissoutes et à
froid, avant le chauffage et l’addition de
gélose (pour les milieux solides)
Gélose ou agar-agar
A ajouter au milieu dès le début du chauffage
ou commencer à chauffer l'eau, puis verser la
gélose
Agiter constamment le milieu jusqu'à dissolution complète de la gélose, puis laisser bouillir
1 à 2 minutes
Ou homogénéiser à froid et mettre au microondes (7 minutes environ par litre de milieu à
1000 W)2
Attention ! Ne pas homogénéiser le milieu à
sa sortie du micro-ondes (retard d'ébullition
possible donc risque de brûlure)
1. Contrôle de conductivité : < 25 pS/cm à + 25 °C (cf. programme n° 100-2 « Analyses biologiques et microbiologiques des eaux » du Cofrac).
2. Matériel et récipients intervenant dans la préparation des milieux de culture (cf. première partie, chapitre 2
« Matériel principal du laboratoire de microbiologie).