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Chapitre 7 : Le clonage
7.1. Principe du clonage
C’est une technique qui repose sur l’insertion d’un fragment d’ADN exogène dans un vecteur
(plasmide, phage, cosmide…). Elle consiste en les étapes suivantes:
- Couper l’ADN et le vecteur par une enzyme de restriction à site unique
- Mélanger l’ADN et le vecteur et les relier à l’aide de la ligase
- Introduire le vecteur dans la cellule hôte
- Sélectionner la cellule recombinante
7.2. Origine de l’ADN à cloner
1- Extraction d’ADN génomique
2- obtention d’un ADNc à partir d’un ARNm : principalement pour les gènes eucaryotes
3- traduction inverse si la protéine est connue
7.3. Les vecteurs de clonage
C’est des molécules d’ADN naturelles ou synthétiques qui ont pour rôle de transporter l’ADN
à insérer dans la cellule hôte et permettre sa réplication et/ou expression (vecteur
d’expression). Ils doivent avoir les caractéristiques suivantes :
- Une origine de réplication
- Un site unique pour une enzyme de restriction
- Un ou deux marqueurs de sélection (facile à sélectionner)
Le meilleur hôte est E. coli et la levure