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5.2. Le mélange réactionnel
5.2.1. Les amorces
Le choix des amorces est crucial. Elles vont avoir un double rôle : en s'hybridant à l'ADN
matrice, elles délimitent la région d’ADN à amplifier (étape 2 du cycle) et avec leur extrémité
3' OH libre servir d’amorce pour l’ADN polymérase (étape 3 du cycle).
Critères de choix des amorces:
- Des oligonucléotides de 20 à 30pb
- Elles se fixent du coté 3’OH
- Faible composition en GC donc faible Tm Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)
- des Tm comparables. Les oligonucléotides amorces doivent s’hybrider à l'ADN
matrice dans les mêmes conditions de température,
- des séquences non complémentaires entre elles,
- des séquences qui ne contiennent pas de séquences répétées inversées (pas de
repliement intramoléculaire).
5.2.2. L’ADN matriciel
Dans la pratique plusieurs copies sont nécessaires pour avoir un résultat correct. Cependant, la
mauvaise qualité et/ou une quantité trop importante d’ADN matrice peut conduire à une
amplification aspécifique, voire à une inhibition enzymatique. Il est possible d’expliquer cette
inhibition par la présence de contaminants provenant de l’échantillon ou des réactifs utilisés
dans les protocoles d’extraction d’ADN.
5.2.3. L’ADN polymérase
La synthèse de l’ADN est assurée par l’ADN polymerase, la plus utilisée provient d'une
bactérie thermophile Thermus aquaticus (Taq polymérase). De nos jours, les enzymes
utilisées sont dites recombinantes, ce qui simplifie considérablement leur obtention, et leurs
propriétés ont été largement modifiées pour les rendre plus efficaces et plus fidèles.
5.2.4. Les dNTP et le tampon
Les dNTP (ATCG) doivent être ajoutés en excès.
Le tampon utilisé pour la réaction PCR sert à maintenir stable le pH du milieu réactionnel au
niveau optimal pour la Taq polymérase (TrisHCl à pH basique 8,5 à 9). Il contient des cations
5.2. Le mélange réactionnel
5.2.1. Les amorces
Le choix des amorces est crucial. Elles vont avoir un double rôle : en s'hybridant à l'ADN
matrice, elles délimitent la région d’ADN à amplifier (étape 2 du cycle) et avec leur extrémité
3' OH libre servir d’amorce pour l’ADN polymérase (étape 3 du cycle).
Critères de choix des amorces:
- Des oligonucléotides de 20 à 30pb
- Elles se fixent du coté 3’OH
- Faible composition en GC donc faible Tm Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)
- des Tm comparables. Les oligonucléotides amorces doivent s’hybrider à l'ADN
matrice dans les mêmes conditions de température,
- des séquences non complémentaires entre elles,
- des séquences qui ne contiennent pas de séquences répétées inversées (pas de
repliement intramoléculaire).
5.2.2. L’ADN matriciel
Dans la pratique plusieurs copies sont nécessaires pour avoir un résultat correct. Cependant, la
mauvaise qualité et/ou une quantité trop importante d’ADN matrice peut conduire à une
amplification aspécifique, voire à une inhibition enzymatique. Il est possible d’expliquer cette
inhibition par la présence de contaminants provenant de l’échantillon ou des réactifs utilisés
dans les protocoles d’extraction d’ADN.
5.2.3. L’ADN polymérase
La synthèse de l’ADN est assurée par l’ADN polymerase, la plus utilisée provient d'une
bactérie thermophile Thermus aquaticus (Taq polymérase). De nos jours, les enzymes
utilisées sont dites recombinantes, ce qui simplifie considérablement leur obtention, et leurs
propriétés ont été largement modifiées pour les rendre plus efficaces et plus fidèles.
5.2.4. Les dNTP et le tampon
Les dNTP (ATCG) doivent être ajoutés en excès.
Le tampon utilisé pour la réaction PCR sert à maintenir stable le pH du milieu réactionnel au
niveau optimal pour la Taq polymérase (TrisHCl à pH basique 8,5 à 9). Il contient des cations