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L’ADN fragmenté par des enzymes de restriction et séparé par électrophorèse, est dénaturé
et transféré du gel sur une membrane de nitrocellulose ou nylon par capillarité.
Après contact avec la sonde dans des conditions favorables d’hybridation, la visualisation se
fait selon le marquage utilisé.
4.4.2.1. Les étapes
1. Fragmentation de l’ADN par une endonucléase de restriction
2. Séparation par électrophorèse des fragments de restrictions en fonction du poids
moléculaire
3. Transfert des fragments du gel sur une feuille de nitrocellulose (ou membrane de
nylon)
4. Dénaturation de l’ADN fixé sur la membrane.
5. Mise en contacte de l’ADN et des sondes marquées en milieu liquide et sous
agitation.
6. Lavage de la feuille pour éliminer les hybridations non spécifiques.
7. Visualisation des sondes fixées
4.4.2.2. Les membranes d’hybridation
La nitrocellulose : représente le premier support d’immobilisation ayant été utilisé
pour la fixation des acides nucléiques. Ce support, requiert une forte concentration
ionique, ce qui permet de créer des liaisons irréversibles sous vide et à 80°C.
Les membranes synthétiques (à base de nylon) : De même, elles nécessitent des
forces ioniques fortes. Ces membranes permettent des liaisons plus stables que celles
obtenues avec la nitrocellulose à cause de leur traitement par les rayons UV courts
(254 nm). Ce type de liaison, va permettre plusieurs déshybridations et réhybridations.
L’ADN fragmenté par des enzymes de restriction et séparé par électrophorèse, est dénaturé
et transféré du gel sur une membrane de nitrocellulose ou nylon par capillarité.
Après contact avec la sonde dans des conditions favorables d’hybridation, la visualisation se
fait selon le marquage utilisé.
4.4.2.1. Les étapes
1. Fragmentation de l’ADN par une endonucléase de restriction
2. Séparation par électrophorèse des fragments de restrictions en fonction du poids
moléculaire
3. Transfert des fragments du gel sur une feuille de nitrocellulose (ou membrane de
nylon)
4. Dénaturation de l’ADN fixé sur la membrane.
5. Mise en contacte de l’ADN et des sondes marquées en milieu liquide et sous
agitation.
6. Lavage de la feuille pour éliminer les hybridations non spécifiques.
7. Visualisation des sondes fixées
4.4.2.2. Les membranes d’hybridation
La nitrocellulose : représente le premier support d’immobilisation ayant été utilisé
pour la fixation des acides nucléiques. Ce support, requiert une forte concentration
ionique, ce qui permet de créer des liaisons irréversibles sous vide et à 80°C.
Les membranes synthétiques (à base de nylon) : De même, elles nécessitent des
forces ioniques fortes. Ces membranes permettent des liaisons plus stables que celles
obtenues avec la nitrocellulose à cause de leur traitement par les rayons UV courts
(254 nm). Ce type de liaison, va permettre plusieurs déshybridations et réhybridations.