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4.4. Les Techniques d’hybridation
4.4.1. Hybridation en milieu liquide
Les segments nucléiques complémentaires sont placés dans une solution contenant un tampon
et de la formamide. L’agitation thermique assure la liaison entre les fragments
complémentaires. Cette réaction se déroule à une température généralement inférieure de
15°C à la Tm de l’ADN concerné.
Ce type d’hybridation est une méthode quantitative qui permet de quantifier les hybrides avec
un dosage par spectrophotométrie à 260nm. L’inconvénient principal de cette méthode est la
formation d’homoduplex.
Afin d’éliminer le dosage des monobrins en excès on utilise:
- la nucléase S1 qui a pour rôle d’éliminer les monobrins
- la chromatographie d’affinité sur hydroxyl apatite (cristaux de polyphosphate de
ca
2+
) qui piège l’ADN double brin : Les acides nucléiques se lient à l'hydroxyapatite
par la vertu d'interactions entre les groupes phosphate du squelette du polynucléotide
et les résidus calcium. Les acides nucléiques peuvent être élués de façon différentielle
en faisant varier la force ionique des tampons phosphates. Les acides nucléiques
peuvent être ainsi séparés des protéines et entre eux, les ADN des ARN et les ADN
simple brins des ADN double-brins. Les ADN double-brins qui sont plus solidement
liés au support nécessitent un tampon plus fort.
Figure 4.5. Les fractions d’élution des ADN simple et double brins d’une
chromatographie d’affinité sur hydroxy-apatite
4.4.2. Hybridation ADN/ADN en milieu solide: Southern blot