. Facteurs de croissance : extraits de levure 1 ; biotrypcase 1 ;
. Substrats : cellobiose ou CMC (carboxyméthylcellulose de sodium) 6-10 g/l.
Après autoclavage en aérobiose, les fioles sont placées sous atmosphère dépourvue
d’oxygène (N2 = 100 %). Le bicarbonate est autoclavé séparément dans des tubes
hermétiquement clos et ajouté avant le dégazage des fioles, en même temps que les
composés non-autoclavables stérilisés par filtration.
Après ensemencement des fioles, des aliquotes de l’atmosphère des fioles et du milieu de
culture sont prélevées toutes les heures et permettent de suivre :
- la disparition du substrat : le cellobiose et la CMC sont respectivement coupés en
molécules de glucose sous l’action d’une β-glucosidase et d’une cellulase, puis le glucose
est dosé par colorimétrie à 610 nm, après action de la glucose-oxydase, en présence de
péroxydase et d’ABTS (Marty, 1983).
- l’apparition et/ou la consommation des métabolites gazeux. . Détermination de H 2 ,
CO2 et CH4 par chromatographie en phase gazeuse à catharomètre (3 colonnes montées
en série : une colonne silicagel, une colonne vide et une colonne tamis moléculaire ;
température du four : 80°C, de l’injecteur : 100°C et du détecteur : 110°C ; filament : 120
mA ; gaz vecteur : Argon).
- l’apparition des alcools. Détermination du méthanol, éthanol, isopropanol, propanol,
isobutanol et butanol par chromatographie en phase gazeuse à ionisation de flamme
(colonne Chromosorb 101 ; température du four : 165°C, de l’injecteur : 190°C et du
détecteur : 175°C ; gaz vecteur : Argon).
- l’apparition et/ou la consommation des acides gras volatils :
. Détermination du formate par dosage colorimétrique à 515 nm, après action chimique
(Lang et Lang, 1972) ;
. Détermination du L et D-lactate par dosage colorimétrique à 340 nm, après action
enzymatique (Tests combinaison Boehringer-Mannheim).
. Détermination de l’acétate, propionate, isobutyrate, butyrate, isovalérate et valérate
par chromatographie en phase gazeuse à ionisation de flamme après acidification par
H3PO4 (colonne Chromosorb WAW, SP 1220 15 % + H 3 PO 4 1 % ; température du four :
120°C, de l’injecteur : 180°C et du détecteur : 160°C ; gaz vecteur : Hélium).
- l’évolution des diverses populations bactériennes impliquées :
. Dénombrement des bactéries méthanogènes par MPN sur milieu H2-CO2/formate
préparé selon la technique de Hungate (1969) ;
. Dénombrement des bactéries cellulolytiques par MPN sur milieu CMC (Marty, 1983) ;
. Dénombrement des bactéries fermentatives non-cellulolytiques sur boîtes de Petri,
milieu gélosé-cellobiose-glucose (Marty, 1983).
- Les cultures réalisées sont :
. monocultures : souche C sur CMC
souche F sur cellobiose
. dicultures : souche C + souche F sur CMC
. tricultures : souche C +souche F + souche M sur CMC
RÉSULTATS ET DISCUSSION
- Les monocultures :
La souche F dégrade le cellobiose en gaz carbonique, acétate, éthanol, lactate, formate et
un peu de butanol et d’hydrogène.
La souche C dégrade la CMC ou le cellobiose en hydrogène, gaz carbonique, acétate,
éthanol, et un peu de propionate, formate et lactate (fig. 1).
- Les dicultures (souche C + souche F sur CMC)
Les dicultures dégradent la CMC en hydrogène, gaz carbonique, acétate, éthanol, un peu
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. Substrats : cellobiose ou CMC (carboxyméthylcellulose de sodium) 6-10 g/l.
Après autoclavage en aérobiose, les fioles sont placées sous atmosphère dépourvue
d’oxygène (N2 = 100 %). Le bicarbonate est autoclavé séparément dans des tubes
hermétiquement clos et ajouté avant le dégazage des fioles, en même temps que les
composés non-autoclavables stérilisés par filtration.
Après ensemencement des fioles, des aliquotes de l’atmosphère des fioles et du milieu de
culture sont prélevées toutes les heures et permettent de suivre :
- la disparition du substrat : le cellobiose et la CMC sont respectivement coupés en
molécules de glucose sous l’action d’une β-glucosidase et d’une cellulase, puis le glucose
est dosé par colorimétrie à 610 nm, après action de la glucose-oxydase, en présence de
péroxydase et d’ABTS (Marty, 1983).
- l’apparition et/ou la consommation des métabolites gazeux. . Détermination de H 2 ,
CO2 et CH4 par chromatographie en phase gazeuse à catharomètre (3 colonnes montées
en série : une colonne silicagel, une colonne vide et une colonne tamis moléculaire ;
température du four : 80°C, de l’injecteur : 100°C et du détecteur : 110°C ; filament : 120
mA ; gaz vecteur : Argon).
- l’apparition des alcools. Détermination du méthanol, éthanol, isopropanol, propanol,
isobutanol et butanol par chromatographie en phase gazeuse à ionisation de flamme
(colonne Chromosorb 101 ; température du four : 165°C, de l’injecteur : 190°C et du
détecteur : 175°C ; gaz vecteur : Argon).
- l’apparition et/ou la consommation des acides gras volatils :
. Détermination du formate par dosage colorimétrique à 515 nm, après action chimique
(Lang et Lang, 1972) ;
. Détermination du L et D-lactate par dosage colorimétrique à 340 nm, après action
enzymatique (Tests combinaison Boehringer-Mannheim).
. Détermination de l’acétate, propionate, isobutyrate, butyrate, isovalérate et valérate
par chromatographie en phase gazeuse à ionisation de flamme après acidification par
H3PO4 (colonne Chromosorb WAW, SP 1220 15 % + H 3 PO 4 1 % ; température du four :
120°C, de l’injecteur : 180°C et du détecteur : 160°C ; gaz vecteur : Hélium).
- l’évolution des diverses populations bactériennes impliquées :
. Dénombrement des bactéries méthanogènes par MPN sur milieu H2-CO2/formate
préparé selon la technique de Hungate (1969) ;
. Dénombrement des bactéries cellulolytiques par MPN sur milieu CMC (Marty, 1983) ;
. Dénombrement des bactéries fermentatives non-cellulolytiques sur boîtes de Petri,
milieu gélosé-cellobiose-glucose (Marty, 1983).
- Les cultures réalisées sont :
. monocultures : souche C sur CMC
souche F sur cellobiose
. dicultures : souche C + souche F sur CMC
. tricultures : souche C +souche F + souche M sur CMC
RÉSULTATS ET DISCUSSION
- Les monocultures :
La souche F dégrade le cellobiose en gaz carbonique, acétate, éthanol, lactate, formate et
un peu de butanol et d’hydrogène.
La souche C dégrade la CMC ou le cellobiose en hydrogène, gaz carbonique, acétate,
éthanol, et un peu de propionate, formate et lactate (fig. 1).
- Les dicultures (souche C + souche F sur CMC)
Les dicultures dégradent la CMC en hydrogène, gaz carbonique, acétate, éthanol, un peu
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