0,2 séries de 4 flacons (a,b,c,d) contenant chacun 50 ml de milieu de culture sont inoculés,
l’une avec 5 x 10 5 bactéries, flacon' 1 , l’autre avec 3.7 x 10 6 diatomées, flacon-1. Le
14 C-acide glutamique est introduit à to + 2 h (flacon a) et à to + 24 h (flacons b et c). De la
peptone (nutriment) est également ajoutée à la culture c à to+ 24h. Le 14 C-glucose est
introduit dans la culture d à to + 24 h. Le 14 C-bicarbonate est fourni aux diatomées à to
(flacon a), to + 2 j (flacon b) et à to +7 j (flacons c et d). Un mélange de nutriments (Na
NO3 + Na H2 PO4 + NA H 2 SiO3) est également ajouté à la culture c à to + 7 j. Après
différents temps d’incubation (5 à 72 h pour les bactéries et 1 à 9 j pour les diatomées), 1 ml
de chaque culture, préalablement agitée, est filtré sur une membrane Nuclepore (polycarbonate) de 0.2 µm de porosité. Les cellules ainsi retenues sont rincées à l’eau de mer stérile,
et leur activité (DPM cell.) mesurée à l’aide d’un appareil à scintillation liquide (Bekman
LS 7000) après dissolution complète du filtre dans du Soluene 100 (Packard) et mélange
de la solution au liquide scintillant (Instagel, Packard). Une numération cellulaire est
effectuée en parallèle. Les mesures (2 à 3 par flacon et par temps) permettent de calculer le
rendement de marquage, c’est-à-dire le rapport de l’activité incorporée dans les cellules à
un instant donné, à la quantité de radioactivité introduite dans la culture au moment du
marquage : %Rendement = (DPM cell./DPM intro.)x100.
Évolution du marquage
Avant toute expérience de nutrition, il est nécessaire de laver les cultures marquées, afin
d’éliminer la radioactivité extracellulaire. Elles sont ensuite placées en eau de mer stérile.
Bien que la durée des expériences de nutrition soit en général courte (quelques heures), des
pertes non négligeables d’activité cellulaire (dialyse, respiration) pourraient survenir du
fait du changement de milieu. Nous avons donc suivi l’évolution de la radioactivité
cellulaire et extracellulaire (sous formes dissoute et gazeuse) dans ces conditions pendant
10 h pour les 2 souches bactérienne et algale.
Au temps 0, une quantité connue de cellules marquées (6 x 10 8 bactéries et 3.2 x 10 6
diatomées) est introduite dans un flacon de culture contenant 50 ml d’eau de mer et
recevant par bullage un air dépourvu de CO2 (après passage dans de la potasse). Le flacon
est bouché et relié à un système capteur de CO2 composé de 2 récepteurs en série
contenant l’un de l’éthanolamine, l’autre de la potasse. Après différents temps d’incubation (1 à 10 h), les flacons sont agités et des prélèvements de 1 ml effectués. Dans le flacon
de culture sont mesurées la concentration cellulaire, l’activité cellulaire (protocole précédent) et l’activité extracellulaire présente sous forme dissoute (le filtrat rincé du ml filtré
pour mesurer l’activité cellulaire est mélangé à de l’Instagel). Dans les flacons capteurs de
CO2 est mesurée l’activité perdue par les cellules sous forme gazeuse. L’aliquot d’éthanolamine est mélangé à du toluène PPO-POPOP (liquide scintillant) après solutilisation
dans du méthanol. L’aliquot de potasse est mélangé à de l’Instagel.
RÉSULTATS ET DISCUSSION
Présentation de la nourriture
- Fixation en fonction du temps (fig. 1)
La figure 1 montre que le nombre de bactéries “fixées” augmente au cours des 24
premières heures d’incubation (maximum : 1.9 x 10 8 bactéries.g -1 ), se maintient aux
alentours de 10
8 bactéries.g -1 jusqu’au 3
e jour, puis diminue.
Marshall et al. (1971) et Fletcher (1977, a, b) qui ont étudié la fixation du genre
Pseudomonas, remarquent une fixation optimale à 20°C en phase exponentielle de
395
l’une avec 5 x 10 5 bactéries, flacon' 1 , l’autre avec 3.7 x 10 6 diatomées, flacon-1. Le
14 C-acide glutamique est introduit à to + 2 h (flacon a) et à to + 24 h (flacons b et c). De la
peptone (nutriment) est également ajoutée à la culture c à to+ 24h. Le 14 C-glucose est
introduit dans la culture d à to + 24 h. Le 14 C-bicarbonate est fourni aux diatomées à to
(flacon a), to + 2 j (flacon b) et à to +7 j (flacons c et d). Un mélange de nutriments (Na
NO3 + Na H2 PO4 + NA H 2 SiO3) est également ajouté à la culture c à to + 7 j. Après
différents temps d’incubation (5 à 72 h pour les bactéries et 1 à 9 j pour les diatomées), 1 ml
de chaque culture, préalablement agitée, est filtré sur une membrane Nuclepore (polycarbonate) de 0.2 µm de porosité. Les cellules ainsi retenues sont rincées à l’eau de mer stérile,
et leur activité (DPM cell.) mesurée à l’aide d’un appareil à scintillation liquide (Bekman
LS 7000) après dissolution complète du filtre dans du Soluene 100 (Packard) et mélange
de la solution au liquide scintillant (Instagel, Packard). Une numération cellulaire est
effectuée en parallèle. Les mesures (2 à 3 par flacon et par temps) permettent de calculer le
rendement de marquage, c’est-à-dire le rapport de l’activité incorporée dans les cellules à
un instant donné, à la quantité de radioactivité introduite dans la culture au moment du
marquage : %Rendement = (DPM cell./DPM intro.)x100.
Évolution du marquage
Avant toute expérience de nutrition, il est nécessaire de laver les cultures marquées, afin
d’éliminer la radioactivité extracellulaire. Elles sont ensuite placées en eau de mer stérile.
Bien que la durée des expériences de nutrition soit en général courte (quelques heures), des
pertes non négligeables d’activité cellulaire (dialyse, respiration) pourraient survenir du
fait du changement de milieu. Nous avons donc suivi l’évolution de la radioactivité
cellulaire et extracellulaire (sous formes dissoute et gazeuse) dans ces conditions pendant
10 h pour les 2 souches bactérienne et algale.
Au temps 0, une quantité connue de cellules marquées (6 x 10 8 bactéries et 3.2 x 10 6
diatomées) est introduite dans un flacon de culture contenant 50 ml d’eau de mer et
recevant par bullage un air dépourvu de CO2 (après passage dans de la potasse). Le flacon
est bouché et relié à un système capteur de CO2 composé de 2 récepteurs en série
contenant l’un de l’éthanolamine, l’autre de la potasse. Après différents temps d’incubation (1 à 10 h), les flacons sont agités et des prélèvements de 1 ml effectués. Dans le flacon
de culture sont mesurées la concentration cellulaire, l’activité cellulaire (protocole précédent) et l’activité extracellulaire présente sous forme dissoute (le filtrat rincé du ml filtré
pour mesurer l’activité cellulaire est mélangé à de l’Instagel). Dans les flacons capteurs de
CO2 est mesurée l’activité perdue par les cellules sous forme gazeuse. L’aliquot d’éthanolamine est mélangé à du toluène PPO-POPOP (liquide scintillant) après solutilisation
dans du méthanol. L’aliquot de potasse est mélangé à de l’Instagel.
RÉSULTATS ET DISCUSSION
Présentation de la nourriture
- Fixation en fonction du temps (fig. 1)
La figure 1 montre que le nombre de bactéries “fixées” augmente au cours des 24
premières heures d’incubation (maximum : 1.9 x 10 8 bactéries.g -1 ), se maintient aux
alentours de 10
8 bactéries.g -1 jusqu’au 3
e jour, puis diminue.
Marshall et al. (1971) et Fletcher (1977, a, b) qui ont étudié la fixation du genre
Pseudomonas, remarquent une fixation optimale à 20°C en phase exponentielle de
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