158
f((/orescences toxiques des eaux côtières françaises :écologie, écophysiologie, toxicologie
Détection et analyse de l'acide
okadaïque
Détection dans les cellules a/gales
L'acide okadaïque a été détecté par immunofluorescence, à l'aide de l' anti corps monoclonallgG1
de souris, réagissant spécifiquement à l' AO. Sur
cet anticorps primaire, un anticorps polyclonal
conjugué de la fluorescéine, spécifique des anticorps de souris a été utilisé afin de le repérer par
flu orescence lorsqu ' il est fixé par I' AO. Cette
technique a été appliquée à la détection de I'AO
dans les cellules de P. lima préalablement conditi onnées (Toku yasu, 1989), pour une v isualisation au MET. Afin de localiser l' AO par rapport au
noyau des cellules algales, l'ADN était marqué au
DAPI à 0, 1iJg/ml.
« L' AO a été détecté dans le cytoplasme des cellules du dinoflagellé, près de la membrane plasmique, dans les chloroplastes périphériques et
occasionnellement près de la membrane nucléaire
dans une position plus centrale. Ces résultats suggèrent que la production d'AO pourrait être liée
aux chloroplastes périphériques, et que l'accumulation d' AO pourrait être associée aux lipides
membranaires » (Rausch, 1993 ; Rausch et al. ,
1995b). L' AO et l'ADN extracellulaires ne sont
jamais superposés, ce qui montre que les bactéries
intracellulaires n' ont pas de pouvoir de biosynthèse et de bioaccumulation de l' AO.
Une étude comparée de la localisation intracel -
lulaire de l' AO dans des cellu les de P. lima issues
d' une culture axénique (Berl and et al., 1972) provenant du même clone que la précédente, a été
fa ite. Elle a montré qu' il n' y a « aucune différence entre les cellules de P. lima provenant des deux
cultures, suggérant que la production d' AO par
P. lima ne nécessite pas la présence de bactéries.
Ces données tendent à démontrer que la production d'AO dans les cellules du dinoflagellé est
endogène >> (Rausch, 1993).
Détection dans les cellules bactériennes
Les extraits c hloroformiques des 26 souches bactéri ennes isolées et c ultivées en milieu liquide
o nt été soumi s au test ELISA. Les lectures des
microplaques ont révélé des réactions positives
sur 18 échantillons, semblables à celles observées
avec I'AO provenant des cellules algales.
Analyse de l'acide okadaïque et de la
DTX1 par CLHP
Dans le but de vérifier les résultats obten us avec
le test ELISA, les souches bactériennes correspondant aux échantillons positifs ont été repiquées et
les extraits chloroform iques analysés par CLHP
(méthode de Lee et al., 1987 ; Stabell et al., 1991 ).
Le protocole de repiquage-extraction (effectué
deux fois consécutives) a montré que le nombre
d 'échantillons toxiques était restreint à une seule
souche bactérienne.
Ces résultats ne confi rment donc pas les lectures
obtenues avec le test ELISA. Il pourrait s'agir dans
le premier cas, de la détection d' une contamination des cultures bactériennes par l' AO issu de la
culture alga le initial e, par adsorption des molécules d' AO par les bactéries par exemple. La disparition progressi ve de l' AO dans les différents
repiquages le confirmerait.
Les résultats ont montré que P. lima et les bactéries
associées contenaient de 71 à 81 % de la toxine
de la culture. L' AO était produit lorsque la croissance de l'a lgue était faible, et semblait indépendante de la croissance bactérienne. Ceci milite en
faveur d' une production d' AO par P. lima.
Les analyses par CLHP ont montré une faib le proportion d' AO dans la fraction bactérienne, mais il
pourrait s'agir d' une contamination, comme cela
a été suggéré auparavant.
Recherche de I'AO dans la phase dissoute d'une culture de P. lima
Une culture non axénique de P. lima a été suivie
toutes les semaines pendant 70 jours afi n d'étudier l' évolution des densités algales et bactériennes, ainsi que les contenus toxiniques dans les
différentes phases (fig. 6, p. 159).
L'AO dans la phase dissoute présentait 19 à 29%
du total toxinique de la culture. La présence d' AO
dans la phase dissoute peut s'expliquer par l' agitation périodique à laquelle étaient soumises les
cultures. Il peut également s'agir d'une production extracellulaire sous forme de DTX4 hydrosoluble, la méthode d'extraction utilisée ne permettant pas de l'estimer sous forme de diol ester sul -
faté mais de son produit d' hydrolyse l' A.O . (Hu
et al., 1995).
f((/orescences toxiques des eaux côtières françaises :écologie, écophysiologie, toxicologie
Détection et analyse de l'acide
okadaïque
Détection dans les cellules a/gales
L'acide okadaïque a été détecté par immunofluorescence, à l'aide de l' anti corps monoclonallgG1
de souris, réagissant spécifiquement à l' AO. Sur
cet anticorps primaire, un anticorps polyclonal
conjugué de la fluorescéine, spécifique des anticorps de souris a été utilisé afin de le repérer par
flu orescence lorsqu ' il est fixé par I' AO. Cette
technique a été appliquée à la détection de I'AO
dans les cellules de P. lima préalablement conditi onnées (Toku yasu, 1989), pour une v isualisation au MET. Afin de localiser l' AO par rapport au
noyau des cellules algales, l'ADN était marqué au
DAPI à 0, 1iJg/ml.
« L' AO a été détecté dans le cytoplasme des cellules du dinoflagellé, près de la membrane plasmique, dans les chloroplastes périphériques et
occasionnellement près de la membrane nucléaire
dans une position plus centrale. Ces résultats suggèrent que la production d'AO pourrait être liée
aux chloroplastes périphériques, et que l'accumulation d' AO pourrait être associée aux lipides
membranaires » (Rausch, 1993 ; Rausch et al. ,
1995b). L' AO et l'ADN extracellulaires ne sont
jamais superposés, ce qui montre que les bactéries
intracellulaires n' ont pas de pouvoir de biosynthèse et de bioaccumulation de l' AO.
Une étude comparée de la localisation intracel -
lulaire de l' AO dans des cellu les de P. lima issues
d' une culture axénique (Berl and et al., 1972) provenant du même clone que la précédente, a été
fa ite. Elle a montré qu' il n' y a « aucune différence entre les cellules de P. lima provenant des deux
cultures, suggérant que la production d' AO par
P. lima ne nécessite pas la présence de bactéries.
Ces données tendent à démontrer que la production d'AO dans les cellules du dinoflagellé est
endogène >> (Rausch, 1993).
Détection dans les cellules bactériennes
Les extraits c hloroformiques des 26 souches bactéri ennes isolées et c ultivées en milieu liquide
o nt été soumi s au test ELISA. Les lectures des
microplaques ont révélé des réactions positives
sur 18 échantillons, semblables à celles observées
avec I'AO provenant des cellules algales.
Analyse de l'acide okadaïque et de la
DTX1 par CLHP
Dans le but de vérifier les résultats obten us avec
le test ELISA, les souches bactériennes correspondant aux échantillons positifs ont été repiquées et
les extraits chloroform iques analysés par CLHP
(méthode de Lee et al., 1987 ; Stabell et al., 1991 ).
Le protocole de repiquage-extraction (effectué
deux fois consécutives) a montré que le nombre
d 'échantillons toxiques était restreint à une seule
souche bactérienne.
Ces résultats ne confi rment donc pas les lectures
obtenues avec le test ELISA. Il pourrait s'agir dans
le premier cas, de la détection d' une contamination des cultures bactériennes par l' AO issu de la
culture alga le initial e, par adsorption des molécules d' AO par les bactéries par exemple. La disparition progressi ve de l' AO dans les différents
repiquages le confirmerait.
Les résultats ont montré que P. lima et les bactéries
associées contenaient de 71 à 81 % de la toxine
de la culture. L' AO était produit lorsque la croissance de l'a lgue était faible, et semblait indépendante de la croissance bactérienne. Ceci milite en
faveur d' une production d' AO par P. lima.
Les analyses par CLHP ont montré une faib le proportion d' AO dans la fraction bactérienne, mais il
pourrait s'agir d' une contamination, comme cela
a été suggéré auparavant.
Recherche de I'AO dans la phase dissoute d'une culture de P. lima
Une culture non axénique de P. lima a été suivie
toutes les semaines pendant 70 jours afi n d'étudier l' évolution des densités algales et bactériennes, ainsi que les contenus toxiniques dans les
différentes phases (fig. 6, p. 159).
L'AO dans la phase dissoute présentait 19 à 29%
du total toxinique de la culture. La présence d' AO
dans la phase dissoute peut s'expliquer par l' agitation périodique à laquelle étaient soumises les
cultures. Il peut également s'agir d'une production extracellulaire sous forme de DTX4 hydrosoluble, la méthode d'extraction utilisée ne permettant pas de l'estimer sous forme de diol ester sul -
faté mais de son produit d' hydrolyse l' A.O . (Hu
et al., 1995).