156
Production de l'acide
okadaïque : l'hypothèse
bactérienne
Détection et isolement des cellules
bactériennes
Détection
La détection des bactéries extra et intracellulaires
associées à P. lima a été réal isée par Rausch et al.
(1995a). Les bactéri es ont été détectées à la surface des cellules de P. lima par microscopie électronique à balayage (MEB) selon la technique de
Soyer et al. (1982). La MEB a permis l' observation de nombreuses bactéries de formes hélicoïdales, allongées ou arrond ies (cocci) :plus de 100
cellules bactériennes par valve de cellule algale
vis ible dans les cultures en fin de phase exponentielle de croissance. Leur répartition à la surface des parois est irrégulière. Les cellu les bactéri ennes ont également été détectées sous forme
d'agglomérats, correspondant probablement à
des agrégations muqueuses à la périphéri e des
cellules végétales. La détection des bactéries à
l' intérieur des cellules algales par mi croscop ie
électronique à transm ission (MET) (Soyer et al.,
1977) a montré des inclusions ressemblant à des
bactéries. Elles étaient situées près de la zone périflagellaire et du pusule. La pénétration des bactéries dans la cellule algale par cette voie n' est pas
à exclure. La structure des bactéries ne semble pas
être modifiée, ce qui laisse supposer une endosymbiose ou un début d' infection de l'algue.
Isolement
Trois cu ltures clonales ont été réalisées en milieu
K, à partir d' une souche algale monospécifique.
Les expériences ont été faites sur des réplicats de
ces clones.
Afin de séparer les d ifférents types de bactéries
associées à la culture de P. lima en fonction de
leur localisation par rapport aux cellul es algales,
des volumes identiques de cultures non axéniques
ont été fi ltrés selon deux procédés (fig. 4) (Rausch,
1993).
Comptage
Pour un comptage direct, la méthode de Albright
et al. (1986) a été adaptée. Les bactéries ont été
colorées avec le DAPI, fluorochrome qui permet
la détection des bactéries filtrées sur Nuclépore.
Les comptages sont faits au microscope à épi -
fi uorescence.
Une méthode de comptage par étalement sur
gélose a également été utilisée (Gélose Nutritive
et Marine Agar). Cette méthode est plus longue
que le comptage direct.
Après comparaison des deux méthodes, la premi ère s'est avérée plus précise (fig. 5, p. 157,
Rausch, 1993).
Après comptage des bactéries contenues dans les
deux filtrats, il est possible de dénombrer les bactéries libres, et celles fixées sur les cellules algales.
Mises en culture
Afin d' isoler les bactéries éventuellement productrices d' acide okadaïque, un maximum de cultures
pures a été réalisé à partir des filtrats obtenus.
culture de P. lima non axénique
--- + Na2P201 0,002 M pendant 20 min.
+ ultrasons 1 00 W pendant 20 sec.
---------------- ------ fi~r~~~~~~~:~~:~~~;!é~~~e~jm -------~------------Filtrats : bactéries associées libres
bactéries associées totales
------- -------- filtration sur Nuclépore 0,2 ~m (retient les bactéries)-- - -- - ------------pour comptages
Figure 4 - Traitement et filtrations des cultures de P. lima non axéniques.
Production de l'acide
okadaïque : l'hypothèse
bactérienne
Détection et isolement des cellules
bactériennes
Détection
La détection des bactéries extra et intracellulaires
associées à P. lima a été réal isée par Rausch et al.
(1995a). Les bactéri es ont été détectées à la surface des cellules de P. lima par microscopie électronique à balayage (MEB) selon la technique de
Soyer et al. (1982). La MEB a permis l' observation de nombreuses bactéries de formes hélicoïdales, allongées ou arrond ies (cocci) :plus de 100
cellules bactériennes par valve de cellule algale
vis ible dans les cultures en fin de phase exponentielle de croissance. Leur répartition à la surface des parois est irrégulière. Les cellu les bactéri ennes ont également été détectées sous forme
d'agglomérats, correspondant probablement à
des agrégations muqueuses à la périphéri e des
cellules végétales. La détection des bactéries à
l' intérieur des cellules algales par mi croscop ie
électronique à transm ission (MET) (Soyer et al.,
1977) a montré des inclusions ressemblant à des
bactéries. Elles étaient situées près de la zone périflagellaire et du pusule. La pénétration des bactéries dans la cellule algale par cette voie n' est pas
à exclure. La structure des bactéries ne semble pas
être modifiée, ce qui laisse supposer une endosymbiose ou un début d' infection de l'algue.
Isolement
Trois cu ltures clonales ont été réalisées en milieu
K, à partir d' une souche algale monospécifique.
Les expériences ont été faites sur des réplicats de
ces clones.
Afin de séparer les d ifférents types de bactéries
associées à la culture de P. lima en fonction de
leur localisation par rapport aux cellul es algales,
des volumes identiques de cultures non axéniques
ont été fi ltrés selon deux procédés (fig. 4) (Rausch,
1993).
Comptage
Pour un comptage direct, la méthode de Albright
et al. (1986) a été adaptée. Les bactéries ont été
colorées avec le DAPI, fluorochrome qui permet
la détection des bactéries filtrées sur Nuclépore.
Les comptages sont faits au microscope à épi -
fi uorescence.
Une méthode de comptage par étalement sur
gélose a également été utilisée (Gélose Nutritive
et Marine Agar). Cette méthode est plus longue
que le comptage direct.
Après comparaison des deux méthodes, la premi ère s'est avérée plus précise (fig. 5, p. 157,
Rausch, 1993).
Après comptage des bactéries contenues dans les
deux filtrats, il est possible de dénombrer les bactéries libres, et celles fixées sur les cellules algales.
Mises en culture
Afin d' isoler les bactéries éventuellement productrices d' acide okadaïque, un maximum de cultures
pures a été réalisé à partir des filtrats obtenus.
culture de P. lima non axénique
--- + Na2P201 0,002 M pendant 20 min.
+ ultrasons 1 00 W pendant 20 sec.
---------------- ------ fi~r~~~~~~~:~~:~~~;!é~~~e~jm -------~------------Filtrats : bactéries associées libres
bactéries associées totales
------- -------- filtration sur Nuclépore 0,2 ~m (retient les bactéries)-- - -- - ------------pour comptages
Figure 4 - Traitement et filtrations des cultures de P. lima non axéniques.