144
E(florescences toxiques des eaux côtières françaises : écologie, écophysiologie, toxicologie
.......... ................................. .. ...................
. ................................................. .
Purification de la maïtotoxine
à partir de cultures
de Gambierdiscus toxicus
L'objectif de ce travail était de préparer de la maïtotoxine (MTX) pour permettre la mise au point
d' un test de cytotoxicité pour la quantification des
toxines ciguatériques.
Cette préparation passait par l' obtention d' une
biomasse importante du dinoflagellé responsab le
de sa production, Gambierdiscus toxicus. À cette
occasion il a été en particulier montré qu' une
limitation de la flore bactérienne associée favorisait une croissance rapide de l' algue sans modifier sa toxicité brute. La purification de la MTX a
été entreprise à partir de 150 g (500.1 0 6 cellules)
de la souche antillaise de Gambierdiscus.
La méthode de préparation employée a été inspirée de celles proposées par Bagnis et al., 1980,
Dickey et al. 1984, et Yokoyama et al. 1988. L' extraction de la MTX à partir des cellules algales a
été effectuée en utilisant le méthanol comme solvant. Sa purification a fait appel au partage liquide-liqu ide, puis à des méthodes c hrom atographiques sur silice, sur silice greffée C18, puis sur
silice greffée C8 (fig. 4, p. 145). Il est à noter que
la stabilité des substances tox iques de l' algue s'est
révélée de plus en plus réduite au long du protocole de purification, des pertes d'activité de 80 %
aya nt même été constatées lors d'évaporations. Il
a été ainsi obtenu une fraction très enrichie en
MTX, présentant une dose minimum létale à
24 heures par voie i.p. chez la souris de 7 mg/kg,
soit 3 750 fois plus faible que celle de l'extrait
méthanolique de départ. Cette fraction MTX a
permis la mise au point des tests de cytotoxicité
envisagés.
Purification et identification
des hémolysines de Gymnodinium cf. nagasakiense
Une étude a été menée pour isoler et identifier les
constituants hémolytiques de cultures de Gymnodinium cf. nagasakiense. Dans le cas d' une espèce voisine (Gyrodinium aureolum), l'action hémolytique a été attribuée à la présence dans les cellules algales d' un acide gras poly insaturé (C18 : 5)
et d' un glycolipide (digalactosyl glycérol monoacyl é également par un acide gras polyinsatu ré
(C20 : 5). L' identité c himique des constituants
actifs dans les deux espèces algales a été recherchée après un fractionnement des extraits lipidiques
intracel lulaires obtenus par les techniques chromatographiques usuelles (se rapporter au chapitre
(( Toxinogénèse » de cet ouvrage).
L'acide gras a été isolé sous forme d'ester méthylique en combi nant successivement les capacités
analytiques des chromatographi es sur co lonne
de silice et sur plaques de silice imprégnées de
n itrate d' argent, pui s la CLHP sur sil ice greffée
C18. Il a été identifié sans ambiguïté à l'acide al/
cis 3, 6, 9,12, 15-octodécapentaenoïque (C18 : 5,
ro-3) par la correspondance des caractéri stiques
spectrales (FAB MS/ MS, IRFT, 1 H NMR) et chromatographiques (CPG,TLC) .
L'étude de la fraction glycol ipidique est en cours
et devrait permettre la préparation de standards
nécessa ires pour d' autres études.
Isolement et identification
des toxines produites par
Prorocentrum minimum
P. minimum est une espèce largement répandue
dans l' hémisphère nord. Sa toxicité, à tropisme
supposé hépatique, était d' un caractère douteux
qui demandait vérification. En effet des cas d' intoxication avaient été rapportés à la suite d'efflorescences, mais ce caractère toxique n' avait été
retrouvé en cu lture que par Silva au Portugal et
Okaichi et lmatomi au Japon. Beaucoup d'autres
essais s'étaient révélés négatifs, mais les souc hes
testées provenaient alors de cu ltu res déjà
anciennes.
L'étude présente a été entreprise à la suite de la
détection d' une toxicité aiguë non expliquée dans
des moules de la région de Leucate (Roussi llon), et
corrél ée à un bloom de cette espèce. Des extraits
de clones méditerranéens récemment isolés s'étant
révélés toxiques pour la souris, il fut décidé de procéder à l' isolement et à la caractéri sati on des
E(florescences toxiques des eaux côtières françaises : écologie, écophysiologie, toxicologie
.......... ................................. .. ...................
. ................................................. .
Purification de la maïtotoxine
à partir de cultures
de Gambierdiscus toxicus
L'objectif de ce travail était de préparer de la maïtotoxine (MTX) pour permettre la mise au point
d' un test de cytotoxicité pour la quantification des
toxines ciguatériques.
Cette préparation passait par l' obtention d' une
biomasse importante du dinoflagellé responsab le
de sa production, Gambierdiscus toxicus. À cette
occasion il a été en particulier montré qu' une
limitation de la flore bactérienne associée favorisait une croissance rapide de l' algue sans modifier sa toxicité brute. La purification de la MTX a
été entreprise à partir de 150 g (500.1 0 6 cellules)
de la souche antillaise de Gambierdiscus.
La méthode de préparation employée a été inspirée de celles proposées par Bagnis et al., 1980,
Dickey et al. 1984, et Yokoyama et al. 1988. L' extraction de la MTX à partir des cellules algales a
été effectuée en utilisant le méthanol comme solvant. Sa purification a fait appel au partage liquide-liqu ide, puis à des méthodes c hrom atographiques sur silice, sur silice greffée C18, puis sur
silice greffée C8 (fig. 4, p. 145). Il est à noter que
la stabilité des substances tox iques de l' algue s'est
révélée de plus en plus réduite au long du protocole de purification, des pertes d'activité de 80 %
aya nt même été constatées lors d'évaporations. Il
a été ainsi obtenu une fraction très enrichie en
MTX, présentant une dose minimum létale à
24 heures par voie i.p. chez la souris de 7 mg/kg,
soit 3 750 fois plus faible que celle de l'extrait
méthanolique de départ. Cette fraction MTX a
permis la mise au point des tests de cytotoxicité
envisagés.
Purification et identification
des hémolysines de Gymnodinium cf. nagasakiense
Une étude a été menée pour isoler et identifier les
constituants hémolytiques de cultures de Gymnodinium cf. nagasakiense. Dans le cas d' une espèce voisine (Gyrodinium aureolum), l'action hémolytique a été attribuée à la présence dans les cellules algales d' un acide gras poly insaturé (C18 : 5)
et d' un glycolipide (digalactosyl glycérol monoacyl é également par un acide gras polyinsatu ré
(C20 : 5). L' identité c himique des constituants
actifs dans les deux espèces algales a été recherchée après un fractionnement des extraits lipidiques
intracel lulaires obtenus par les techniques chromatographiques usuelles (se rapporter au chapitre
(( Toxinogénèse » de cet ouvrage).
L'acide gras a été isolé sous forme d'ester méthylique en combi nant successivement les capacités
analytiques des chromatographi es sur co lonne
de silice et sur plaques de silice imprégnées de
n itrate d' argent, pui s la CLHP sur sil ice greffée
C18. Il a été identifié sans ambiguïté à l'acide al/
cis 3, 6, 9,12, 15-octodécapentaenoïque (C18 : 5,
ro-3) par la correspondance des caractéri stiques
spectrales (FAB MS/ MS, IRFT, 1 H NMR) et chromatographiques (CPG,TLC) .
L'étude de la fraction glycol ipidique est en cours
et devrait permettre la préparation de standards
nécessa ires pour d' autres études.
Isolement et identification
des toxines produites par
Prorocentrum minimum
P. minimum est une espèce largement répandue
dans l' hémisphère nord. Sa toxicité, à tropisme
supposé hépatique, était d' un caractère douteux
qui demandait vérification. En effet des cas d' intoxication avaient été rapportés à la suite d'efflorescences, mais ce caractère toxique n' avait été
retrouvé en cu lture que par Silva au Portugal et
Okaichi et lmatomi au Japon. Beaucoup d'autres
essais s'étaient révélés négatifs, mais les souc hes
testées provenaient alors de cu ltu res déjà
anciennes.
L'étude présente a été entreprise à la suite de la
détection d' une toxicité aiguë non expliquée dans
des moules de la région de Leucate (Roussi llon), et
corrél ée à un bloom de cette espèce. Des extraits
de clones méditerranéens récemment isolés s'étant
révélés toxiques pour la souris, il fut décidé de procéder à l' isolement et à la caractéri sati on des