Chimie analytique
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Mise au point d'un test
immunologique de détection
de l'acide okadaïque (AO)
L' acide okadaïque n'étant pas non plus une molécule immunogénique, il est nécessaire avant tout
essai de production d'anticorps chez des animaux
de la coupler à une protéine porteuse (immunogène). Deux programmes d'expérimentation ont
été menés.
Premier programme
L' immunogène a été préparé par couplage d'acide
okadaïque avec de la BSA (Bovine Serum Albumine) par la méthode à la carbodiimide. Quatre
souri s ont été immunisées et le suivi de l' immunisation s'est fait par le test ELISA avec l'immunogène couplé sur plaque en tampon carbonate de
sodium à pH 9,6. La révélation se fait à l'aide d'un
anticorps seconda ire marqué à la peroxydase.
Dès la deuxième injection, les sérums montrent
un titre élevé en anticorps (DO= 1,2 pour sérums
dilués au 1/50e).
Pour la fusion, 40 6 splénocytes par souris ont été
utilisés. La culture des hybridomes en milieu sélectif dans des puits a montré 74,5% de développements positifs et, après amplification, 5 puits su r
24 contena ient des hybridomes produisant l'anticorps recherché. Les deux hybridomes donnant les
meil leurs résultats en test ELISA ont été clonés
deux fois par la méthode de di lution limite.
Ensuite, des tests d' inhibition ont été réalisés sur
plaque ELISA « nappée » avec l' immun ogène
(AO-BSA) par incubation préalable des anticorps
dilués avec du conjugué (AO-BSA) ou de l' acide
okadaïque libre. Parallèlement un anticorps
monoclonal canadien (Laboratoire Rougier) a été
testé de la même façon (titrage et test d'inhibition
sur AO et AO- BSA. Il apparaît, au terme de ces
essais, que les anticorps produits en cours d'étude reconnaissent spécifiquement le conjugué
(AO-BSA) mais ne sont pas inhibés par l' acide
okadaïque libre au contraire de l'anticorps canadien, et, de ce fait, ne peuvent être utilisés pour la
mise au point d' un test de détection.
Second programme
L' immunogène a été préparé par coup lage de
l' AO avec de la KLH par la méthode à la carbodiimide.
Les deux espèces, lapins et souris, ont été immunisées avec ce conjugué.
Les sérums de lapin ont été testés pour leur capacité à reconnaître l'ac ide okadaïque libre (test
d' inhibition). Comme le montre la figure 10, le
sérum au 1/2 000 n'est pas inhibé par l'acide okadaïque à une concentration de 20 f.Jg/ml. Pour
Inhibition par l'acide okadaïque l ibre
Sérum lapin
1/2000
1,6
1,4
1,2
E
c
If)
0
0,8
"7"
0 0 ,6
Ac cana di en ~g /ml
ci
0,4
0,2
~
0~.
•
•
•
•
•
20
10
5
2,5
1,25
0,625
0,312
0
Quantité d"acide okadaïque (~g/ml)
Figure 10 - Inhibition par I'AO libre de l'anticorps canadien et du sérum polyclona/ de lapin obtenu.
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Mise au point d'un test
immunologique de détection
de l'acide okadaïque (AO)
L' acide okadaïque n'étant pas non plus une molécule immunogénique, il est nécessaire avant tout
essai de production d'anticorps chez des animaux
de la coupler à une protéine porteuse (immunogène). Deux programmes d'expérimentation ont
été menés.
Premier programme
L' immunogène a été préparé par couplage d'acide
okadaïque avec de la BSA (Bovine Serum Albumine) par la méthode à la carbodiimide. Quatre
souri s ont été immunisées et le suivi de l' immunisation s'est fait par le test ELISA avec l'immunogène couplé sur plaque en tampon carbonate de
sodium à pH 9,6. La révélation se fait à l'aide d'un
anticorps seconda ire marqué à la peroxydase.
Dès la deuxième injection, les sérums montrent
un titre élevé en anticorps (DO= 1,2 pour sérums
dilués au 1/50e).
Pour la fusion, 40 6 splénocytes par souris ont été
utilisés. La culture des hybridomes en milieu sélectif dans des puits a montré 74,5% de développements positifs et, après amplification, 5 puits su r
24 contena ient des hybridomes produisant l'anticorps recherché. Les deux hybridomes donnant les
meil leurs résultats en test ELISA ont été clonés
deux fois par la méthode de di lution limite.
Ensuite, des tests d' inhibition ont été réalisés sur
plaque ELISA « nappée » avec l' immun ogène
(AO-BSA) par incubation préalable des anticorps
dilués avec du conjugué (AO-BSA) ou de l' acide
okadaïque libre. Parallèlement un anticorps
monoclonal canadien (Laboratoire Rougier) a été
testé de la même façon (titrage et test d'inhibition
sur AO et AO- BSA. Il apparaît, au terme de ces
essais, que les anticorps produits en cours d'étude reconnaissent spécifiquement le conjugué
(AO-BSA) mais ne sont pas inhibés par l' acide
okadaïque libre au contraire de l'anticorps canadien, et, de ce fait, ne peuvent être utilisés pour la
mise au point d' un test de détection.
Second programme
L' immunogène a été préparé par coup lage de
l' AO avec de la KLH par la méthode à la carbodiimide.
Les deux espèces, lapins et souris, ont été immunisées avec ce conjugué.
Les sérums de lapin ont été testés pour leur capacité à reconnaître l'ac ide okadaïque libre (test
d' inhibition). Comme le montre la figure 10, le
sérum au 1/2 000 n'est pas inhibé par l'acide okadaïque à une concentration de 20 f.Jg/ml. Pour
Inhibition par l'acide okadaïque l ibre
Sérum lapin
1/2000
1,6
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0,2
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Quantité d"acide okadaïque (~g/ml)
Figure 10 - Inhibition par I'AO libre de l'anticorps canadien et du sérum polyclona/ de lapin obtenu.
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