Chim ie analytique
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Colonne
Débit
Température colonne
Éluants:
PRP-1 , 150 x 4,6 mm, 10 1-1m
1,3 ml/mn
35 oc
A:
1,5 mM C6 sulfonate NH 4
1,5 mM C7 sulfonate
B :
1,5 mM C 6 -sulfonate NH 4
1,5 mM Crsulfonate N H 4
6,25 mM phosph. NH 4
pH 7,05
1,5 mM phosph. NH 4
pH 6,90
25 % acétonitrile
Programme Gradient : {à ajuster en fonction de la colonne)
Oxydant:
Temps {mn)
% A
0,0
100
6,0
13,0
22,0
22,5
23,5
100
80
50
0
0
% B
0
0
20
50
100
100
24,0
100
0
30,0
100
0
5 mM H 5 1 0 6
Acide : HN0 3 0,75 M
100 mM phosph. amm.
0,3 ml/mn
pH 7, 75
0,5 ml/mn
Température réaction : 85 °(
Volume réaction
: 1 ml
Détecteur
:excitation 340 mm, émission 400 nm {fentes 5 nm)
Tableau 1 - Conditions chromatographiques de la méthode Sullivan (modifiées par M. Ledoux).
La méthode Sullivan util ise la chromatographie
anionique {contre-ion = alkylsulfonate) ; la séparation s'effectue sur colonne poly {styrène-divinylbenzène) en mode gradient de force ionique,
de polarité et de pH de la phase mobile. Les
conditions chromatographiques préconisées par
l'auteur ont été légèrement modifiées afin d'optimiser la séparation {tabl. 1 ).
Si cette méthode, en mode gradient d' élution, permet en une seule injection {35 minutes) l'analyse
qualitative de toutes les toxines, elle ne permet ni
la quantification des toxines C, ni une bonne séparation des toxines carbamates de leurs homologues
décarbamoylés. De plus, il a été constaté une mauvaise reproductibilité des colonnes PRP-1 {Hamilton), conseillées par Sullivan ; aussi les colonnes
PLRP-S {Polymer Lab) donnant de meilleurs résultats leur ont été préférées.
La technique de séparation proposée par O shima
est une chromatographie d'appariement d' ions à
la fois anionique et cationique. En effet, la séparation se fait en trois anal yses isocratiques sur
une colonne de silice greffée C-8. Chacune de ces
analyses utilise des conditions chromatographiques spécifiques de chacun des trois groupes
de phycotoxines paralysantes. La méthode Oshima a permis d' individualiser toutes les toxines
paralysantes disponibles en standard au sein du
Laboratoire TOMI du CNEVA-Paris. Il a été cependant nécessaire de faire varier plusieurs paramètres par rapport aux conditions préconisées par
Oshima :pH, pourcentage de solvant organique,
température de colonne {tabl. 2, p. 122).
721
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Colonne
Débit
Température colonne
Éluants:
PRP-1 , 150 x 4,6 mm, 10 1-1m
1,3 ml/mn
35 oc
A:
1,5 mM C6 sulfonate NH 4
1,5 mM C7 sulfonate
B :
1,5 mM C 6 -sulfonate NH 4
1,5 mM Crsulfonate N H 4
6,25 mM phosph. NH 4
pH 7,05
1,5 mM phosph. NH 4
pH 6,90
25 % acétonitrile
Programme Gradient : {à ajuster en fonction de la colonne)
Oxydant:
Temps {mn)
% A
0,0
100
6,0
13,0
22,0
22,5
23,5
100
80
50
0
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% B
0
0
20
50
100
100
24,0
100
0
30,0
100
0
5 mM H 5 1 0 6
Acide : HN0 3 0,75 M
100 mM phosph. amm.
0,3 ml/mn
pH 7, 75
0,5 ml/mn
Température réaction : 85 °(
Volume réaction
: 1 ml
Détecteur
:excitation 340 mm, émission 400 nm {fentes 5 nm)
Tableau 1 - Conditions chromatographiques de la méthode Sullivan (modifiées par M. Ledoux).
La méthode Sullivan util ise la chromatographie
anionique {contre-ion = alkylsulfonate) ; la séparation s'effectue sur colonne poly {styrène-divinylbenzène) en mode gradient de force ionique,
de polarité et de pH de la phase mobile. Les
conditions chromatographiques préconisées par
l'auteur ont été légèrement modifiées afin d'optimiser la séparation {tabl. 1 ).
Si cette méthode, en mode gradient d' élution, permet en une seule injection {35 minutes) l'analyse
qualitative de toutes les toxines, elle ne permet ni
la quantification des toxines C, ni une bonne séparation des toxines carbamates de leurs homologues
décarbamoylés. De plus, il a été constaté une mauvaise reproductibilité des colonnes PRP-1 {Hamilton), conseillées par Sullivan ; aussi les colonnes
PLRP-S {Polymer Lab) donnant de meilleurs résultats leur ont été préférées.
La technique de séparation proposée par O shima
est une chromatographie d'appariement d' ions à
la fois anionique et cationique. En effet, la séparation se fait en trois anal yses isocratiques sur
une colonne de silice greffée C-8. Chacune de ces
analyses utilise des conditions chromatographiques spécifiques de chacun des trois groupes
de phycotoxines paralysantes. La méthode Oshima a permis d' individualiser toutes les toxines
paralysantes disponibles en standard au sein du
Laboratoire TOMI du CNEVA-Paris. Il a été cependant nécessaire de faire varier plusieurs paramètres par rapport aux conditions préconisées par
Oshima :pH, pourcentage de solvant organique,
température de colonne {tabl. 2, p. 122).
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