Une bonne corrélation a été trouvée entre les
résultats de l'analyse chimique, exprimés en
concentration d' AO, et ceux obtenus par le test
microcrustacé à partir des mêmes extra its : r =
-0,85 (p< 0,001 , n = 12).
Ce test peut être un outi l de détection des DSP
pour les laboratoires maintenant un élevage de
daphnies en permanence. Il est peu onéreux, ne
demande aucune technicité particulière et utilise
peu d' échanti llon toxique : il faut environ 4 ~g
d'AO pour déterminer précisément une CEl 50.
Test de cytotoxicité
Test de cytotoxicité à court terme sur
cellules KB
Le mode d' action de l' AO et de son dérivé, la
DTX1 , est une inhibition spécifique de trois des
quatre grandes familles de protéines phosphatases : les PP1 , PP2A et PP2B (Bialojan et al.,
1988). Ces enzymes so nt impliquées dans les
mécanismes de contrôle des événements cellulaires par déphosphorylation de protéines sur les
résidus sérine ou thréonine (Cohen, 1988). Cette
inhibition a probablement des répercussions sur
le réseau d' actine, constituant du cytosq uelette,
qui se traduisent par des modifications morphologiques du contour cellulai re. Cette propriété des
toxines diarrhéiques est mise à profit dans ce test
(Amzil et al., 1992).
Le modèle utilisé est une lignée cellulaire KB provenant d' un carcinome humain de nasopharynx
(Eagle, 1955). Le test se réalise dans des microplaques où l'o n répartit des aliquotes de la suspension cellulai re. Après dépôt des cell ules dans
le fond des puits, on ajoute les solutions toxiques
préparées à partir d' une gamme de concentrations
en progression géométrique. La modification morphologique est visible trois ou quatre heures après
suivant les dilutions : des cellules, en nombre plus
ou moins grand, deviennent rondes. Par examen
microscopique direct des microplaq ues on détermine la concentration minimale active ou C.M.A.
en IJg/ml.
La méthode présente une bonne reproductibilité
pui sq ue 95 % des échanti llo ns donnent, au
mo ins, trois mesures identiques sur quatre et la
Tests biologiques
quatrième, quand elle est différente, varie seulement d' une di lution . Sa limite de détection est :
12,5 ng AO soit 0,03 US et 1,6 ng pou r la DTX-1.
Comme elle est spéc ifique des substances qui
agissent sur les phosphatases (PP2A), dans nos
échantillons ce sont les toxines diarrhéiques, les
au tres phycotoxines n' interfèrent pas. De plus, il
existe une bonne corrélati on entre la CMA et le
logarithme des concentrations en AO trouvées par
CLHP : r =-0,90 ; n = 11 ; p < 0,001 (Amzil et al.,
1992). Enfin, dans la mesure où le laboratoire possède la culture, la détermination de la CMA pour
quelques échantillons peut être obtenue dans la
journée.
En vue de proposer une alternative au test souris,
les tests daphnie et de cytotoxicité ont été comparés respectivement avec l'analyse chimique et
le test souris (Marcaillou-Le Baut et al., 1994).
Sur 16 échantil lons l'étude a confirmé la bonne
corrélation avec l' analyse chimique et a montré
une relation satisfaisante avec le test souris (tabl. 1,
p. 111 , fig. 1 p. 11 2)
Test souris
Ln US en g Hp
Test daphnies :
r = -0,89
Ln CIE 50- 24 h en mg HP par ml
n = 16
Test de cytotoxicité :
r = -0,90
Ln CMA en mg Hp par ml
n = 16
Tableau 7 - Coefficients de corrélation calculés entre les résultats du test souris et ceux des deux autres bioessais
En concl usion à cette étude, les deux tests proposés pour détecter les DSP, à savoir la recherche
de la CEl 50 - 24 heures sur daphnie et la détermination de la CMA sur cellu les KB pourra ient
être des alternatives au test souris. Dans les deux
cas, la procédure a été longuement éprouvée car
ces deux essais sont pratiqués en routine par différentes équipes pour d' autres objectifs. Ils donnent une réponse fiable en 24 heures et ne nécessitent pas un matériel coûteux pour leur mise en
œuvre. Leur contrainte réside dans l'entretien
d' un élevage de daphnies dans un cas, d' une culture cellul aire dans l'autre, tout au long de l' année et dans des conditions de disponibilité immédiate en cas de besoin. Il reste, cependant, à
éprouver ces tests sur le terrain dans un contexte
de surveillance.
771
résultats de l'analyse chimique, exprimés en
concentration d' AO, et ceux obtenus par le test
microcrustacé à partir des mêmes extra its : r =
-0,85 (p< 0,001 , n = 12).
Ce test peut être un outi l de détection des DSP
pour les laboratoires maintenant un élevage de
daphnies en permanence. Il est peu onéreux, ne
demande aucune technicité particulière et utilise
peu d' échanti llon toxique : il faut environ 4 ~g
d'AO pour déterminer précisément une CEl 50.
Test de cytotoxicité
Test de cytotoxicité à court terme sur
cellules KB
Le mode d' action de l' AO et de son dérivé, la
DTX1 , est une inhibition spécifique de trois des
quatre grandes familles de protéines phosphatases : les PP1 , PP2A et PP2B (Bialojan et al.,
1988). Ces enzymes so nt impliquées dans les
mécanismes de contrôle des événements cellulaires par déphosphorylation de protéines sur les
résidus sérine ou thréonine (Cohen, 1988). Cette
inhibition a probablement des répercussions sur
le réseau d' actine, constituant du cytosq uelette,
qui se traduisent par des modifications morphologiques du contour cellulai re. Cette propriété des
toxines diarrhéiques est mise à profit dans ce test
(Amzil et al., 1992).
Le modèle utilisé est une lignée cellulaire KB provenant d' un carcinome humain de nasopharynx
(Eagle, 1955). Le test se réalise dans des microplaques où l'o n répartit des aliquotes de la suspension cellulai re. Après dépôt des cell ules dans
le fond des puits, on ajoute les solutions toxiques
préparées à partir d' une gamme de concentrations
en progression géométrique. La modification morphologique est visible trois ou quatre heures après
suivant les dilutions : des cellules, en nombre plus
ou moins grand, deviennent rondes. Par examen
microscopique direct des microplaq ues on détermine la concentration minimale active ou C.M.A.
en IJg/ml.
La méthode présente une bonne reproductibilité
pui sq ue 95 % des échanti llo ns donnent, au
mo ins, trois mesures identiques sur quatre et la
Tests biologiques
quatrième, quand elle est différente, varie seulement d' une di lution . Sa limite de détection est :
12,5 ng AO soit 0,03 US et 1,6 ng pou r la DTX-1.
Comme elle est spéc ifique des substances qui
agissent sur les phosphatases (PP2A), dans nos
échantillons ce sont les toxines diarrhéiques, les
au tres phycotoxines n' interfèrent pas. De plus, il
existe une bonne corrélati on entre la CMA et le
logarithme des concentrations en AO trouvées par
CLHP : r =-0,90 ; n = 11 ; p < 0,001 (Amzil et al.,
1992). Enfin, dans la mesure où le laboratoire possède la culture, la détermination de la CMA pour
quelques échantillons peut être obtenue dans la
journée.
En vue de proposer une alternative au test souris,
les tests daphnie et de cytotoxicité ont été comparés respectivement avec l'analyse chimique et
le test souris (Marcaillou-Le Baut et al., 1994).
Sur 16 échantil lons l'étude a confirmé la bonne
corrélation avec l' analyse chimique et a montré
une relation satisfaisante avec le test souris (tabl. 1,
p. 111 , fig. 1 p. 11 2)
Test souris
Ln US en g Hp
Test daphnies :
r = -0,89
Ln CIE 50- 24 h en mg HP par ml
n = 16
Test de cytotoxicité :
r = -0,90
Ln CMA en mg Hp par ml
n = 16
Tableau 7 - Coefficients de corrélation calculés entre les résultats du test souris et ceux des deux autres bioessais
En concl usion à cette étude, les deux tests proposés pour détecter les DSP, à savoir la recherche
de la CEl 50 - 24 heures sur daphnie et la détermination de la CMA sur cellu les KB pourra ient
être des alternatives au test souris. Dans les deux
cas, la procédure a été longuement éprouvée car
ces deux essais sont pratiqués en routine par différentes équipes pour d' autres objectifs. Ils donnent une réponse fiable en 24 heures et ne nécessitent pas un matériel coûteux pour leur mise en
œuvre. Leur contrainte réside dans l'entretien
d' un élevage de daphnies dans un cas, d' une culture cellul aire dans l'autre, tout au long de l' année et dans des conditions de disponibilité immédiate en cas de besoin. Il reste, cependant, à
éprouver ces tests sur le terrain dans un contexte
de surveillance.
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