Chapitre II
MATERIEL ET METHODES
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4.5.3 Techniques de caractérisation et d’identification des bactéries
4.5.3.1 La coloration de Gram
Cette technique doit son nom au bactériologiste danois Hans Christian Gram qui a mis au point
son protocole en 1884.
C'est une coloration qui permet de mettre en évidence les propriétés de la paroi bactérienne, et
d'utiliser ces propriétés pour la distinction entre deux groupes bactériens, les Gram +, dotées
d'une simple paroi avec une grande quantité de peptidoglycane et les Gram -, composées de
moins de peptidoglycane mais pourvues d'une membrane externe supplémentaire.
a. principe
Le violet de gentiane se fixe sur des composants cytoplasmiques et après un temps de coloration,
toutes les bactéries sont violettes. Chez les bactéries à Gram négatif, la paroi, riche en lipides,
laisse passer l'alcool (ou le mélange alcool + acétone) qui décolore le cytoplasme alors que, chez
les bactéries à Gram positif, la paroi constitue une barrière imperméable à l'alcool et le
cytoplasme demeure coloré en violet.
b. Procédure
-Etaler les bactéries sur une lame de verre ;
- Fixer le frottis à la chaleur et colorer pendant une minute avec une solution de violet de
gentiane ;
- Fixer la coloration du frottis par une solution iodo-ioduré de lugol , pendant une minute ;
-Décolorer le frottis avec l’alcool à 95 % pendant quelques secondes (30sec), puis rincé
immédiatement avec l’eau du robinet ;
- Traiter le frottis avec une solution de Fushine pendant une minute ;
- Rincer rapidement au robinet et sécher.
c. Lecture
Après ce traitement, les cellules Gram négatif apparaissent roses et les cellules Gram positif
apparaissent sous une couleur violette (SINGLETON et SAINSBURY, 1984)(Figure II.11)