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i.
dénaturation (denaturation) des deux brins d’ADN à température élevée (autour de 95°C)
permet d’obtenir des molécules d’ADN monocaténaires ;
ii.
hybridation (annealing) d’oligonucléotides (amorces ou primers) complémentaires d’une
séquence de l’ADN monocaténaire à plus basse température (de 40 à 60°C) afin de
permettre une bonne fixation des amorces ;
iii.
élongation (extension) par une ADN polymérase thermostable (la TAQ polymérase) à partir
des primers, réalisée à température optimale (72°C).
Séquençage automatique de l’ADN
Le séquençage ne se réalise pas sur l’ADNg mais sur les fragments amplifiés de la région du
marqueur à analyser. Plusieurs techniques sont utilisées. Nous retiendrons celle de Sanger et al
(1977) basée sur le séquençage enzymatique par incorporation de didésoxynucléotides triphosphate
(ddNTP). Une amorce nucléotidique est hybridée par appariement de bases au fragment d’ADN
monocaténaire dont on veut déterminer la séquence. A partir de l’extrémité 3’-OH de l’amorce
appariée, une ADN polymérase synthétise le brin complémentaire de l’ADN matrice en présence de
ddNTP. La température choisie permet d’incorporer des didésoxynucléotides triphosphates. Chaque
fois qu’un ddNTP est incorporé à une position, l’élongation de la chaîne est stoppée, ce qui génère
un ensemble de molécules de taille différentes, mais se terminant toujours par le même ddNTP. Si
le désoxynucléotide triphosphate (dNTP) et le ddNTP correspondant sont ajoutés en quantités
adéquates, tous les fragments d’ADN synthétisés de novo seront représentés. On n’utilisera ici
qu’une seule amorce et donc un seul brin sera copié. ; la température est de l’ordre de 50°C . Le
primer est hybridé par appariement de bases au fragment d’ADN monocaténaire dont on veut
déterminer la séquence. L’ADN polymérase utilisée pour la réaction est thermostable, et la
polymérisation se fait dans un appareil de type PCR où l’on retrouve, comme pour l’amplification,
entre 20 et 40 cycles de 3 étapes (dénaturation, hybridation, élongation).
Ce processus est donc réalisé par un séquenceur automatique l’ABIPrism 310 Genetic Analyser
(Applied Biosystems). La méthode utilisée est celle dite du ‘Dye terminator’ où les ddNTP sont
marqués chacun par un fluorophore spécifique. Le ddNTP ayant une couleur spécifique, il sera
possible de détecter la couleur de la dernière base d’un fragment donné par le séquenceur
automatique. Les échantillons sont préparés manuellement puis déposés sur un chargeur
automatique. L’ABI Prism 310
DT
prélève automatiquement l’échantillon et le place sur le capillaire
pour électrophorèse afin de séparer les fragments d’ADN.
i.
dénaturation (denaturation) des deux brins d’ADN à température élevée (autour de 95°C)
permet d’obtenir des molécules d’ADN monocaténaires ;
ii.
hybridation (annealing) d’oligonucléotides (amorces ou primers) complémentaires d’une
séquence de l’ADN monocaténaire à plus basse température (de 40 à 60°C) afin de
permettre une bonne fixation des amorces ;
iii.
élongation (extension) par une ADN polymérase thermostable (la TAQ polymérase) à partir
des primers, réalisée à température optimale (72°C).
Séquençage automatique de l’ADN
Le séquençage ne se réalise pas sur l’ADNg mais sur les fragments amplifiés de la région du
marqueur à analyser. Plusieurs techniques sont utilisées. Nous retiendrons celle de Sanger et al
(1977) basée sur le séquençage enzymatique par incorporation de didésoxynucléotides triphosphate
(ddNTP). Une amorce nucléotidique est hybridée par appariement de bases au fragment d’ADN
monocaténaire dont on veut déterminer la séquence. A partir de l’extrémité 3’-OH de l’amorce
appariée, une ADN polymérase synthétise le brin complémentaire de l’ADN matrice en présence de
ddNTP. La température choisie permet d’incorporer des didésoxynucléotides triphosphates. Chaque
fois qu’un ddNTP est incorporé à une position, l’élongation de la chaîne est stoppée, ce qui génère
un ensemble de molécules de taille différentes, mais se terminant toujours par le même ddNTP. Si
le désoxynucléotide triphosphate (dNTP) et le ddNTP correspondant sont ajoutés en quantités
adéquates, tous les fragments d’ADN synthétisés de novo seront représentés. On n’utilisera ici
qu’une seule amorce et donc un seul brin sera copié. ; la température est de l’ordre de 50°C . Le
primer est hybridé par appariement de bases au fragment d’ADN monocaténaire dont on veut
déterminer la séquence. L’ADN polymérase utilisée pour la réaction est thermostable, et la
polymérisation se fait dans un appareil de type PCR où l’on retrouve, comme pour l’amplification,
entre 20 et 40 cycles de 3 étapes (dénaturation, hybridation, élongation).
Ce processus est donc réalisé par un séquenceur automatique l’ABIPrism 310 Genetic Analyser
(Applied Biosystems). La méthode utilisée est celle dite du ‘Dye terminator’ où les ddNTP sont
marqués chacun par un fluorophore spécifique. Le ddNTP ayant une couleur spécifique, il sera
possible de détecter la couleur de la dernière base d’un fragment donné par le séquenceur
automatique. Les échantillons sont préparés manuellement puis déposés sur un chargeur
automatique. L’ABI Prism 310
DT
prélève automatiquement l’échantillon et le place sur le capillaire
pour électrophorèse afin de séparer les fragments d’ADN.