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Certains marqueurs génétiques (ont permis de mener des investigations interspecifiques concluantes
chez les Elasmobranches : le gène codant pour l’enzyme NADH (Naylor et al., 1997) et celui
codant pour le cytochrome b, fréquemment utilise comme base de comparaison entre les différents
genres de requins et de raies (Kitamura et al, 1996a). Ce gène a également servi à l’étude des
relations phylogénétiques des raies de l’océan Indien (Sezaki et al, 1999).
Pour les différentes espèces de raies de la région atlanto-méditerranéennes, un marqueur approprié à
ce groupe au phénotype variable et souvent incertain, est largement utilisé. Il s’agit du gène 16S de
l’ADNmt (fig. 10), plus précisément une partie de ce gène, correspondant a une séquence
nucléotidique d’environ 240 paires de base et qui est caractérisée par une grande variabilité (Parker
et Kornfield, 1996). Cette région montre un haplotype caractérisant chacune des différentes espèces
qui ont été analysées (Tinti et al, 2003; Valsecchi et al, 2004). Ce marqueur génétique 16S ADNr a
également permis l’identification de nombreuses espèces de poissons (Apostolidis et al, 2001).
2.2.2. Principe des techniques de génétique moléculaire
Tagu (1999) synthétise de fort belle manière les principes des techniques de biologie moléculaire.
L’auteur précise que la caractérisation fine d’un gène (ou d’une région de ce gène) passe par son
séquençage, c’est a dire la connaissance de la composition et de l’ordre des nucléotides qui le
composent. Pour y arriver, deux étapes la précédent : l’extraction et l’amplification ou PCR.
Extraction : l’ADN génomique (ADNg) se trouve dans le noyau des Eucaryotes et dans les
mitochondries (et les chloroplastes).Un fragment de tissu musculaire ou de nageoire permet de
collecter l’ADN à analyser. L’ADNg après lyse des protéines cellulaires par la protéinase-K est
extrait, entre autres par la méthode C-TAB (Miller et al, 1988). Après une incubation à 55°C
pendant 4 heures, toutes les structures autres que les acides nucléiques sont dégradées. Les
molécules d’ADN sont séparées progressivement de ces résidus par des solvants organiques (le
chloroforme ou un mélange phenyl-chloroforme) et précipitent sous l’effet du NaCl et de l’éthanol.
On dilue alors l’ADNg dans un tampon aqueux, le TE1X (Sambrock et al, 1989) Une
électrophorèse de contrôle sur gel d’agarose (0.8X) permet d’évaluer la qualité et la quantité
d’ADNg extrait. Ce contrôle détermine la suite des opérations : continuer le protocole ou refaire
l’extraction.
Amplification :
La Polymérase Chain Reaction (PCR) ou méthode PCR est relativement récente, puisque le premier
travail l’utilisant est apparu dans le milieu des années 1980 (Saiki et al, 1985). La PCR permet
d’obtenir un très grand nombre de copies d’un gène à partir d’une petite quantité d’ADN de départ.
Cette technique, qui repose sur la répétition (de 20 à 40 fois) de trois processus ; consiste à
amplifier in vitro un fragment spécifique d’ADN sous l’action d’une enzyme, l’ADN polymérase :
Certains marqueurs génétiques (ont permis de mener des investigations interspecifiques concluantes
chez les Elasmobranches : le gène codant pour l’enzyme NADH (Naylor et al., 1997) et celui
codant pour le cytochrome b, fréquemment utilise comme base de comparaison entre les différents
genres de requins et de raies (Kitamura et al, 1996a). Ce gène a également servi à l’étude des
relations phylogénétiques des raies de l’océan Indien (Sezaki et al, 1999).
Pour les différentes espèces de raies de la région atlanto-méditerranéennes, un marqueur approprié à
ce groupe au phénotype variable et souvent incertain, est largement utilisé. Il s’agit du gène 16S de
l’ADNmt (fig. 10), plus précisément une partie de ce gène, correspondant a une séquence
nucléotidique d’environ 240 paires de base et qui est caractérisée par une grande variabilité (Parker
et Kornfield, 1996). Cette région montre un haplotype caractérisant chacune des différentes espèces
qui ont été analysées (Tinti et al, 2003; Valsecchi et al, 2004). Ce marqueur génétique 16S ADNr a
également permis l’identification de nombreuses espèces de poissons (Apostolidis et al, 2001).
2.2.2. Principe des techniques de génétique moléculaire
Tagu (1999) synthétise de fort belle manière les principes des techniques de biologie moléculaire.
L’auteur précise que la caractérisation fine d’un gène (ou d’une région de ce gène) passe par son
séquençage, c’est a dire la connaissance de la composition et de l’ordre des nucléotides qui le
composent. Pour y arriver, deux étapes la précédent : l’extraction et l’amplification ou PCR.
Extraction : l’ADN génomique (ADNg) se trouve dans le noyau des Eucaryotes et dans les
mitochondries (et les chloroplastes).Un fragment de tissu musculaire ou de nageoire permet de
collecter l’ADN à analyser. L’ADNg après lyse des protéines cellulaires par la protéinase-K est
extrait, entre autres par la méthode C-TAB (Miller et al, 1988). Après une incubation à 55°C
pendant 4 heures, toutes les structures autres que les acides nucléiques sont dégradées. Les
molécules d’ADN sont séparées progressivement de ces résidus par des solvants organiques (le
chloroforme ou un mélange phenyl-chloroforme) et précipitent sous l’effet du NaCl et de l’éthanol.
On dilue alors l’ADNg dans un tampon aqueux, le TE1X (Sambrock et al, 1989) Une
électrophorèse de contrôle sur gel d’agarose (0.8X) permet d’évaluer la qualité et la quantité
d’ADNg extrait. Ce contrôle détermine la suite des opérations : continuer le protocole ou refaire
l’extraction.
Amplification :
La Polymérase Chain Reaction (PCR) ou méthode PCR est relativement récente, puisque le premier
travail l’utilisant est apparu dans le milieu des années 1980 (Saiki et al, 1985). La PCR permet
d’obtenir un très grand nombre de copies d’un gène à partir d’une petite quantité d’ADN de départ.
Cette technique, qui repose sur la répétition (de 20 à 40 fois) de trois processus ; consiste à
amplifier in vitro un fragment spécifique d’ADN sous l’action d’une enzyme, l’ADN polymérase :