Contribution à l’étude des variations des teneurs en phénols totaux
chez la Magnoliophyte marine Posidonia oceanica (L. ) Delile
Matériel et méthodes
17
3.4. Etude des composés phénoliques totaux
3.4.1. Tri et lyophilisation des échantillons
Un fois au laboratoire et à l‟abri d la lumière, les faisceaux destinés au dosage des composés
phénoliques sont immédiatement séparés en 3 lots de 15 faisceaux, puis disséqués selon le
protocole de GIRAUD (1979). Les feuilles sont débarrassées de leurs épiphytes, à l‟aide
d‟une lame de verre puis rincées à l‟eau distillée. Les différents types de tissus : limbes des
feuilles adultes, feuilles intermédiaires et bases, sont déshydratés par sublimation à basse
température (-55°C) et sous vide (10
-3
mbar) à l‟aide d‟un lyophilisateur (modèle SHAIST®,
BETA-1-8). Au bout de 72 heures, les échantillons sont retirés du lyophilisateur, puis
stockés à l‟abri de l‟humidité et de la lumière dans des flacons opaques et hermétiquement
clos. Ainsi conditionnés, les teneurs en composés phénoliques restent constantes
(HARBORNE, 1983).
3.4.2. Extraction
Le protocole adopté pour l‟extraction des composés phénoliques est celui élaboré par
SAUVESTY et al. (1992) pour les végétaux terrestres, et adapté pour la Magnoliophyte
marine Posidonia oceanica par CUNY et al. (1995). Pour chaque lot, 3 g de poids sec de
chacun des tissus sont mis à infuser pendant 3 heures dans 200 ml d‟éthanol aqueux (50%
v/v ; éthanol – 99,8%, Riedel-de Haën). L‟infusion se fait à reflux, à l‟obscurité et au bainmarie (40°C). Les échantillons sont ensuite placés sous vide, au bain-marie à 45°C
(rotavapor –BÜCHI R-114 et B-480), et l‟éthanol ainsi distillé est séparé par condensation le
long d‟une colonne de refroidissement. L‟extraction se fait à l‟aide d‟acétate d‟éthyle (2 ×
25 ml; acétate d‟éthyle – 99,8% Carlo-Erba). Les phases aqueuse et organique sont séparées
dans une ampoule à décanter. La phase organique des échantillons est alors asséchée par
ajout de sulfate de sodium anhydre (Na 2 SO 4 – SIGMA@) afin d‟éliminer toute présence
d‟eau, puis filtrée (filtre Whatman, Macherey-Nagel). Le séchage se fait ensuite sous jet
d‟azote jusqu‟à l‟obtention d‟un résidu sec, qui est repris dans 1 ml de méthanol
(99,5%, Fluka) dans des ampoules ambrées (Figure 6). En outre, afin de soustraire le bruit
de fond lié au mode opératoire, chaque série de 6 échantillons est accompagnée d‟un blanc ;
il est préparé de la même manière que les échantillons, sauf qu‟aucun échantillon n‟est
ajouté. Les échantillons sont ensuite conservés au réfrigérateur jusqu‟à leur dosage.
chez la Magnoliophyte marine Posidonia oceanica (L. ) Delile
Matériel et méthodes
17
3.4. Etude des composés phénoliques totaux
3.4.1. Tri et lyophilisation des échantillons
Un fois au laboratoire et à l‟abri d la lumière, les faisceaux destinés au dosage des composés
phénoliques sont immédiatement séparés en 3 lots de 15 faisceaux, puis disséqués selon le
protocole de GIRAUD (1979). Les feuilles sont débarrassées de leurs épiphytes, à l‟aide
d‟une lame de verre puis rincées à l‟eau distillée. Les différents types de tissus : limbes des
feuilles adultes, feuilles intermédiaires et bases, sont déshydratés par sublimation à basse
température (-55°C) et sous vide (10
-3
mbar) à l‟aide d‟un lyophilisateur (modèle SHAIST®,
BETA-1-8). Au bout de 72 heures, les échantillons sont retirés du lyophilisateur, puis
stockés à l‟abri de l‟humidité et de la lumière dans des flacons opaques et hermétiquement
clos. Ainsi conditionnés, les teneurs en composés phénoliques restent constantes
(HARBORNE, 1983).
3.4.2. Extraction
Le protocole adopté pour l‟extraction des composés phénoliques est celui élaboré par
SAUVESTY et al. (1992) pour les végétaux terrestres, et adapté pour la Magnoliophyte
marine Posidonia oceanica par CUNY et al. (1995). Pour chaque lot, 3 g de poids sec de
chacun des tissus sont mis à infuser pendant 3 heures dans 200 ml d‟éthanol aqueux (50%
v/v ; éthanol – 99,8%, Riedel-de Haën). L‟infusion se fait à reflux, à l‟obscurité et au bainmarie (40°C). Les échantillons sont ensuite placés sous vide, au bain-marie à 45°C
(rotavapor –BÜCHI R-114 et B-480), et l‟éthanol ainsi distillé est séparé par condensation le
long d‟une colonne de refroidissement. L‟extraction se fait à l‟aide d‟acétate d‟éthyle (2 ×
25 ml; acétate d‟éthyle – 99,8% Carlo-Erba). Les phases aqueuse et organique sont séparées
dans une ampoule à décanter. La phase organique des échantillons est alors asséchée par
ajout de sulfate de sodium anhydre (Na 2 SO 4 – SIGMA@) afin d‟éliminer toute présence
d‟eau, puis filtrée (filtre Whatman, Macherey-Nagel). Le séchage se fait ensuite sous jet
d‟azote jusqu‟à l‟obtention d‟un résidu sec, qui est repris dans 1 ml de méthanol
(99,5%, Fluka) dans des ampoules ambrées (Figure 6). En outre, afin de soustraire le bruit
de fond lié au mode opératoire, chaque série de 6 échantillons est accompagnée d‟un blanc ;
il est préparé de la même manière que les échantillons, sauf qu‟aucun échantillon n‟est
ajouté. Les échantillons sont ensuite conservés au réfrigérateur jusqu‟à leur dosage.