Chapitre II
Matériel et méthodes
27
II.3.3. Analyse microbiologique
L’objectif de l’analyse bactériologique de nos échantillons n’est pas d’effectuer un
inventaire de toutes les espèces présentes mais de rechercher les pathogènes qui accompagnent les
indicateurs de contamination fécale. Les germes test recherchés sont les coliformes totaux, fécaux,
E. coli, streptocoques fécaux, les staphylocoques, les sulfitoréducteurs, les vibrions et les
salmonelles, ainsi que des mycètes (levures et moisissures au niveau de la chair des oursins).
Dans notre étude, trois matrices ont fait l’objet de l’examen bactériologique : Eau de mer,
sédiments et oursins.
II.3.3.1. Analyse bactériologique de l’eau de mer
II.3.3.1.1. Dénombrement des coliformes, des streptocoques fécaux et des staphylocoques
Dans notre étude nous avons opté pour la méthode de filtration sur membrane pour estimer
la charge bactérienne dans la zone d’étude. C’est la méthode de concentration la plus utilisée au
laboratoire, pour sa facilité et sa reproductibilité. Elle consiste en une filtration de l’eau sur des
membranes de porosité 0,45µm susceptibles de retenir les bactéries avec un quadrillage en
surface facilitant les dénombrements.
a) Matériel :
- Dispositif de filtration de marque « Sartorius stedim » (figure 11)
- Bec-Bunsen pour garder tout au long de la manipulation la zone de travail stérile ;
- Boites de Pétri avec les milieux de culture spécifiques pour chaque germe ;
- Membranes d’ester de cellulose, filtrantes, quadrillées et stériles (en emballage individuel)
de porosité de 0.45µm et de 47 mm de diamètre
susceptibles de retenir les bactéries ;
- Deux Incubateurs (Etuves) ;
- Pompe à vide ;
- Pinces stérilisées et Pipettes.
b) Mode opératoire
- Stériliser le dispositif de filtration ;
- Mettre en place le dispositif ;
- Mettre le filtre sur la grille ;
- Filtrer un volume d’échantillon (100ml) ;
- Déposer le filtre sur le milieu de culture adapté pour chaque bactérie recherchée;
- Incuber les boites à la température adéquate.
La composition des milieux de culture et des réactifs utilisés est consignée en annexe II.
c) Dénombrement des Coliformes totaux et Coliformes thermotolérants «fécaux»
Cette méthode conduit à un dénombrement présomptif des coliformes totaux et des
coliformes fécaux. Le nombre de colonies trouvées sera exprimé en Unité Formant Colonie dans
100 ml d’eau analysée (UFC/100ml). La flore bactérienne associée est généralement beaucoup
moins abondante dans la boîte incubée à 44°C (Figure 12).
d) Dénombrement des Streptocoques fécaux
Deux tests sont effectués. Le premier est présomptif et réalisé sur le milieu de Slanetz
et Bartley. Le second est confirmatif et réalisé sur gélose BEA (Figure 13).
Figure11: Dispositif de l’appareil de filtration
sur membrane.